n基因的克隆猪的方法，其特征在于，主要按照w下步骤进 行： 第一步、构建Leptin基因过量表达载体 1) 用PCR法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到PMD18-T 载体上，得到重组质粒pMDlS-L巧tin; 2) 酶切pIRES2-AcGFPl载体和PMD18-L巧tin载体，利用胶回收试剂盒对所 需的片段大小进行回收，将Leptin连接到pIRES2-AcGFPl载体上，得到重组质粒 pLeptin-I肥S2-AcGFPl; 3) 采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin-IRES2-AcGFP 1载体进行回收和纯化，-20°C保存备用； 第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选 1) 利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用； 2) 复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞 全部死亡的最适浓度为50化g/ul; 3) 再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90 %时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲 液重悬，并加入30ugleptin过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFPl，移入电击杯中进行转 染； 4) 电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，4化后收集细胞进行 初步鉴定和极度稀释培养； 5) 根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度 为50化g/ul的G418的含有10 %FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，lOd 后能得到牛津杯大小单克隆点； 6) 在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，膜酶消化法枢出单克隆点放入48孔板 中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的DMEM完全培养基（含10%FB巧进行培养，每 天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴 定是否是阳性，一份用于扩大培养； 7) 待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取细胞基因组DNA，通过 PCR鉴定是否是阳性，对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用； 第Ξ步、Leptin细胞的核移植及胚胎移植 1) 受体卵母细胞的培养 a、 从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室； b、 挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟培养 液滴中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中培养38-4化； 2) 构建过量表达Leptin基因的重构胚 曰、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0. 5%FBS的DMEM培养4她，使体细胞处 于G。或G1期； b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.Img.mL1透明质酸去除卵母细胞外 围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0. 5-比，在操作液中用显 微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转 Leptin基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中； 3) 电融合和电激活重构胚 再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗Ξ遍，进行重构胚的电融合处理，完成后 移入NCSU23培养基中培养化，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗Ξ遍，然后进行 电激活，重构胚移入含有2.化g.血iCB的培养液中后放入含有5%C02、5% 02、38. 5°C的Ξ 气培养箱中平衡化； 4) 重构胚的体外培养 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于Ξ气培养箱中培养至胚胎移植； 5) 将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转 Leptin基因的克隆仔猪； 第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证 利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验证。2. 根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法， 其特征在于：在第一步中，体外重组Leptin基因通过线性化过量表达质粒载体 pLeptin-IRES2-AcGFPl来特异地增强基因的表达量。3. 根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特 征在于：在第一步构建Leptin基因过量表达载体中，在重组Leptin基因过量表达载体 pLeptin-IRES2-AcGFPl时，在对pIRES2-AcGFPl载体和PMD18-L巧tin载体进行酶切重组 时，采用SalI和EcoRI进行双酶切，其具体步骤为： a、PCR扩增体系： Leptin-F(GGCCGCiGA. iSCACiTCC) 如 1 f.opLin-R(TCAGCAGCCAGGGCTGAG) 如1 Taq酶 25ul LeptincDNA模板 1山 双蒸水 20ul 总体积 日Oul b、pMD18-L巧tin载体的构建按下列体系在16°C的恒溫金属浴中连接化进行： L.白p'tm義因 说1 PMW8-T载棘 liil 双蒸水 lul. SolutionISul 总体积 lOul c、SalI和EcoRI双酶切pIRES2-AcGFPl载体和pMDlS-Leiptin，时间为化，其反应条 件如下： SalI酶 0.r)ul EcoRI酶 0.oul 10X11Buri.or 2ul 质粒DNA 5ul 双蒸水 12ul 总体积 孤ul t将Leptin和PIRES2-EGFP1连接反应体系如下，反应条件为16°C的恒溫 金属浴中连接化； Leptin 4ul 戟体plR蛇2-悦FPllul SolutionIiul 总体积 lOiiU4. 根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在 于：在第二步猪胎儿成纤维细胞转染、筛选过程中，在第3)步的再次复苏细胞时，加入30ug Leptin过量表达载体pL巧tin-IRES2-AcGFPl后，移入电击杯中，按照如下参数进行转染： 方波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间Os，电击杯厚度4mm。5.根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在 于：在第Ξ步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行受体卵母细胞的成熟培养时，挑选 直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.Img.ml1丙酬酸、0.Img. ml心半脫氨酸盐酸、10%猪卵泡液、Wng.血lEGF的TCM-199成熟培养液滴中，在5%%， 38. 5°C的培养箱中培养38-4化。6.根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在 于：在第Ξ步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行电融合和电激活重构胚时，再将每 批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗立遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时程为20μS，脉冲次 数为1次的电融合参数下进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培养2小 时，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗Ξ遍，然后在150V/mm脉冲电压，脉冲时程 为100μS，脉冲次数为1次的电激活参数下进行电激活，重构胚移入含有2.化g.mLiCB的 培养液中后放入含有5%C02、5% 02、38. 5°C的Ξ气培养箱中平衡化。
【专利摘要】本发明涉及一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，属于分子生物学领域；该方法主要包括pLeptin-IRES2-EGFP1过量表达载体的构建、过量表达pLeptin-IRES2-EGFP1质粒的转染，筛选并获得过量表达Leptin基因的阳性细胞系，再利用体细胞核移植技术构建转Leptin基因的重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得转Leptin基因的克隆仔猪，取转Leptin基因克隆猪组织做过量表达验证，后期再进行转Leptin克隆猪的病理学观察和鉴定。本发明实现了Leptin基因在猪上的过量表达，该方法操作性简单、可靠性高，具有较高的实用性，为人类研究与Leptin基因功能相关代谢疾病的分子机理提供了可靠的模型和重要的参考意义。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/873, A61D19/04, C12N15/85
【公开号】CN105238817
【申请号】CN201510715885
【发明人】魏红江, 李鸿辉, 赵红业, 卿玉波, 角德灵
【申请人】魏红江, 李鸿辉
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月29日