专利名称：人自吞噬基因Beclin 1启动子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域；更具体地，本发明涉及人自吞噬基因启动子， 以及该启动子的应用。
背景技术：
自吞噬是一种广泛存在的生理机制，其主要是将细胞质中的大分子物质 (如蛋白质、糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的 衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持
细胞自身稳定的过程。自吞噬具有多种生理功能，例如①在养料缺乏时为细 胞提供营养；②细胞分化；③细胞死亡及老化；④阻止癌症的发生。自吞噬还 与多种疾病的病理过程有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症 和心力衰竭等。
人自吞噬基因beclin 1是最早发现的哺乳动物中参与自吞噬的基因。研 究表明该基因具有诱导自吞噬、抗病毒、抑制肿瘤生长和参与胚胎早期发育等 多种重要生物功能。然而，对于该基因的表达调控研究还很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于自吞噬基因beclin 1启动子区域的启动 子及其用途。
本发明的另一目的在于提供含有所述启动子的表达载体以及宿主细胞。 本发明的另一目的在于提供一种利用所述的启动子高表达目的基因的方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的核酸(启动子)，所述核酸序列选自
下组
(1)具有SEQ ID N0: 1中第(368±50)-(816±25)位所示序列的核酸序列;或
(2) 在严格条件下能够与(1)限定的核酸序列杂交且具有指导目的基因高 水平表达功能的核酸序列；
(3) 与(1)限定的核酸序列有95%以上同源性且具有指导目的基因高水平表
达功能的核酸序列。
(4) 与(1)-(3)任一限定的核酸序列互补(优选完全互补)的核酸序列。
在另一优选例中，所述的"高水平表达"是指利用本发明的核酸(本发
明的启动子)作为启动子元件指导一目的基因的表达与利用具有SEQ ID NO: 1
序列的启动子指导该目的基因表达相比，利用本发明的核酸所得的表达量高 50%,优选地表达量高100°/。，更优选地表达量高200%，进一步优选地表达量高 300%或更高。
在另一优选例中，(l)项中，具有SEQ ID N0: l中第(368±20)-(831±10) 位所示序列的核酸序列；优选的，具有SEQ ID NO: 1中第(368± 10)-(836±5) 位所示序列的核酸序列。更优选的，具有SEQ ID NO: 1中第368-841位所示序 列的核酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为 启动子元件。
在另一优选例中，所述的载体是真核表达载体。
在另一优选例中，所述的载体中不含有SEQ ID NO: l所示的核酸序列。 在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。 在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是与 所述的核酸序列直接邻近的编码基因的序列。通常，所述的核酸序列与目的基 因序列的间隔小于500bp(优选的，小于200bp;更优选的，小于100bp;最优选 的，小于50bp)。
在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)自吞噬基因(beclin 1)、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白。
5在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含 有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的核酸以及与该核酸可操作地 连接的目的基因。
在另一优选例中，所述的细胞选自(但不限于)大肠杆菌细胞、人永生化
肝正常细胞L02、肝癌细胞H印G2、肝癌细胞BEL-7404、人胚胎肾细胞HEK-293T、 或人乳腺癌细胞MCF-7。
在本发明的第四方面，提供所述的核酸的用途，用于作为启动子元件，指 导目的基因的高表达。
在本发明的第五方面，提供一种高表达目的基因的方法，所述的方法包括
(a) 在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；和
(b) 从培养物中分离出目的蛋白(即由目的基因表达的蛋白)。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。
图1显示不同长度的beclin 1启动子片段在L02细胞中的活力测定，鉴 定出beclin l基因5，上游-277/+197区域具有最大活力，beclin 1基因5， 上游-58/+197区域包含了最基本的启动子区域。
图2显示不同长度的beclin 1启动子片段在BEL-7404(A)和H印G2(B)细 胞中的活力测定，证明beclin 1启动子在肝癌细胞中具有活性，且beclin 1 基因5'上游-277/+197区域具有最高的活性。
图3显示不同长度的beclin 1启动子在HEK-293T细胞中的活力测定，证 明beclin 1启动子在人胚胎肾细胞中具有活性，且beclin 1基因5'上游 -277/+197区域具有最高的活性。
图4显示不同长度的beclin 1启动子在MCF7细胞中的活力测定，证明 beclin 1启动子在乳腺癌细胞中具有活性，且beclin 1基因5，上游-277/+197 区域具有最高的活性。
图5显示beclin 1启动子序列以及其中潜在的转录因子结合位点。箭头
6表示转录起始位点。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地找到一种核酸，将其作为启动子 元件，可指导目的基因高水平表达。本发明的启动子来源于自吞噬基因Beclinl 的启动子区域。本发明的启动子具有广泛的活性，在不同类型的宿主细胞中均 能够指导目的基因高水平表达，无细胞种类的特异性。在此基础上完成了本发 明。
如本文所用，所述的"启动子"或"启动子区(域)"是指一种核酸序列， 其通常存在于目的基因编码序列的上游(5'端)，能够引导核酸序列转录为 mRNA。 一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其 它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体， 其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然 的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸 和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在 的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序 列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特 定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被 "可操作地连接"到该核酸序列上。
如本文所用，所述的"高水平表达"是指利用本发明的启动子指导一目 的基因(如荧光素酶基因)的表达与利用具有SEQ ID NO: 1序列的启动子指导 该目的基因表达相比，利用本发明的启动子所得的表达量高50%,优选地表达 量高100%,更优选地表达量高200%，进一步优选地表达量高300%或更高。蛋 白表达量的检测是本领域技术人员熟知的技术。启动子及其指导的基因表达本发明人在研究过程中，发现全长的人beclin l基因的启动子(序列如图 5所示)的活性不够高，并且意外地发现利用人beclin 1基因启动子序列第(368 ±50)-(816±25)位(优选的是第(368 ±20)-(831±10)位，更优选的是第 368-841位)区域构建的真核表达载体，可以高强度地启动外源基因的大量表 达。因此，本发明提供一种分离的核酸，所述的核酸具有SEQIDN0: 1中第 (368±50)-(816±25)位所示的核苷酸序列，所述的核酸可作为指导目的基因表 达的启动子元件。此外，本发明还包括上述核酸的一些具有相同功能的变异体。包括序列在严格条件下能够与SEQ ID NO: 1中第(368±50) -(816±25)位所示 的序列杂交且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸；或序列与SEQ ID NO: 1中第(368土50)-(816±25)位所示的序列有95%以上 同源性且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸；或序列与SEQ ID NO: 1中第(368±50)-(816±25)位所示的多核苷酸序列互 补(优选完全互补)的核酸。多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特 性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ IDN0: 1中第(36S ±50)-(816±25)位所示的核酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地 至少70%,更佳地至少80% (例如85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、或99%)相 同性的核酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述核酸可杂交的多核苷 酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如O. 2XSSC， 0. 1%SDS， 60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50y。(v/v) 甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. l%Ficoll， 42'C等；或(3)仅在两条序列之间的相同 性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的核酸也具有 指导目的基因高水平表达的功能。在本发明的实例中，在本发明的核酸(本发明的启动子)的指导下，可以使 荧光素酶(Luciferase)基因高水平地表达。因此可见，本发明的启动子是一种特别适合于指导目的基因表达的启动子，在基因表达的研究中具有重要的应 用价值。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启 动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如 一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如 某些具有重要特性或功能的蛋白。
例如，所述的目的基因包括但不限于自吞噬基因(beclin 1)、荧光素酶
基因等。荧光素酶作为一种代表性的指示基因表达状况的工具，可良好地指示 由启动子指导的基因表达情况。而由本发明的启动子可指导荧光素酶高表达这 一实例，可显而易见地得知本发明的启动子作为基因调控元件，可指导其它任 何合适的基因的高表达。
作为本发明的优选方式，所述的目的基因可以是一种对于某一待治疗的哺
乳动物而言缺失或表达量不足的基因，可将该目的基因与本发明的启动子可操 作地连接，或将目的基因与本发明的启动子可操作的连接入合适的载体中，采 取适当的方式导入到适当的细胞内，并传递到待治疗的哺乳动物的体内，从而 高水平地表达目的基因。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目 的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种 期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基 酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外， 改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动 子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技 术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
本发明的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。
所述的重组载体一般包括(从5'到3'方向)引导目的基因转录的启动
子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3'转录终止子，3'
多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标 记、增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语"表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是真核表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或
目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。
作为本发明的一种实例，所述的载体是pGL3-Basic，其本身含有编码荧光素酶基因的序列。通过改造，即利用pGL3-Basic上的多克隆位点，可将本发明的启动子区域构建到荧光素酶编码基因的前面，转化宿主细胞，启动子将激活荧光素酶编码基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，酵母，动物的组织细胞，植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子或宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。
10如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明的实验还证明了本发明的启动子无细胞种类的特异性，在BEL-7404细胞(人肝癌细胞)，H印G2细胞(人肝癌细胞)，HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)和MCF7细胞(人乳腺癌细胞)中都具有广泛的活性。本领域人员可理解，启动子作为基因调控元件，其应用范围与启动子所在的细胞有关，而与其所指导的外源基因的表达与否及基因本身关系不大。本发明的启动子的活性不依赖于细胞种类，因而可被广泛地应用。
在本发明的一个实例中，含有SEQ ID NO: 1中第368-841位所示的核苷酸序列的片段被克隆到真核表达载体pGL3-Basic质粒报告基因的5'上游，构建成p(-277/+197)表达载体，该载体还含有虫萤光素酶报告基因。将该载体导入真核细胞，通过检测虫萤光素酶的活力，来确定外源基因的表达高低。将p(-277/+197)克隆瞬时转染H印G2细胞，发现本发明的beclin l启动子(-277/+197)片段能增强虫萤光素酶基因表达80倍以上。
本发明的主要优点在于
(1) 揭示一种可指导目的基因高水平表达的启动子，利用本发明的启动子可以高强度地启动目的基因的大量表达。
(2) 所述的启动子具有广泛的活性，在不同类型的宿主细胞中均能够指导目的基因高水平表达，无细胞种类的特异性。因此该启动子序列具有应用范围广泛的优点。
(3) 本发明的启动子是人源的启动子，可构建于真核表达载体，在人体细胞中应用，为人类疾病的治疗提供了新的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
人beclin 1基因启动子序列的PCR扩增
首先从市售人正常肝细胞株L02(购自中国科学院细胞库)抽提出细胞基因组DNA，即在收集的培养细胞样品中(5X107)，加入IO倍体积的抽提缓冲液(IOmM Tris-HC1 pH 8.0， 0.1 M EDTA pH 8.0, 20 u g/mL RNA酶，0.5% SDS)，37'C反应1小时，加入蛋白酶K至终浓度为100 "g/ml， 5(TC水浴3小时，期间不时搅动。冷却到室温，加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀后12，000 rpm离心5分钟，收集上清液，用酚氯仿和氯仿再各抽提一次后，用2倍体积的无水乙醇沉淀基因组DNA，所得基因组DNA用适量的TE充分溶解，置于4'C保存。
获得了 L02细胞基因组DNA后，再利用PCR法，以5， -AGA TCT AGA CGG GATTTA ACC AT-3' (SEQ ID NO: 2,带下划线的部分是加入的^711酶切位点)和5， -GGGAAGGGACTCCAATA-3， (SEQ ID NO: 3)分别为上、下游引物扩增beclinl启动子-644/+197片段。 -
PCR反应在25pl体系中进行，包括1^1 L02基因组DNA溶液(100ng/ul),dNTP混合物(每一种dNTP各10 mM)，上下游引物(IO pM)各lpl， 2. 5jil10xPCR缓冲液，0.125^1 Taq酶。PCR反应条件为94。C处理2分钟；之后是32个循环，每个循环包括94'C处理1分钟，55t:处理40秒，72'C处理1分钟；72。C处理10分钟。
PCR扩增得到的beclin 1启动子-644/+197片段经生物公司测序，其序列与人类基因组测序结果核对相符。
实施例2
人beclin 1基因启动子真核表达载体的构建
PCR扩增得到的beclin 1启动子-644/+197片段被正向或反向插入到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)内，以获得含有适当酶切位点的质粒pMD18-T-beclinl (-644/+197)和pMD18-T-beclinl-rev (+197/-644)。
利用BglII和HindIII酶切pMD18-T-beclinl (-644/+197)获得含841bp启动子序列(SEQ ID NO: l)的片段，再将该片段通过BglII和HindIII酶切位
12点插入到真核表达载体pGL3-Basic (购自Promega公司)的虫荧光素酶报告基因的5，端上游，这样就完成了 p (-644/+197)质粒(即含有正向插入的SEQ ID NO:
l序列的质粒)的构建。
要完成口(+197/-644)质粒(即含有反向插入的SEQ ID NO: 1序列的质粒)的构建须先利用BglII和Kpnl酶切pMD18-T-beclinl-rev (+197/-644)获得含841bp启动子序列的片段，再将该片段通过BglII和Kpnl酶切位点插入到pGL3-Basic中。
对于p(-277/+197)质粒(即含有SEQ ID NO: 1序列中第368-841位的质粒)的构建，先用Smal和Eco72I酶切p(-644Al97)质粒，得到的载体补平末端后通过自我连接即可。
用Sacl酶切p(-644Al97)质粒，得到的载体通过自我连接可获得p(-58/+197)质粒(即含有SEQ ID NO: 1序列中第587-841位的质粒)。
此外，Sacl酶切p (-644/+197)质粒得到的片段还可以被插入到pGL3-Basic载体上的SacI酶切位点，鉴定插入方向后获得p(-644/-59)质粒(即含有SEQIDNO: l序列中第卜586位的质粒)。
经过上述操作，不同长度的beclin 1启动子序列就被克隆到了虫荧光素酶报告基因5'端上游。以上操作所使用的限制性内切酶均购自大连Takara公司，为确保酶切反应进行完全，每l"g质粒DNA均通过IO单位的限制性内切酶37。C处理2小时以上。DNA限制性内切酶反应体系包含1-5叫DNA， 1/10总体积的IOX酶切缓冲液和适量DNA限制性内切酶，反应体积一般为20 pl。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后分离片段和载体，紫外灯下将目的片段和/或载体从胶中切割出后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海TIANGEN生物公司)纯化得到片段和载体。
纯化的片段和载体经T4连接酶(大连Takara公司)16'C连接8小时以上，连接产物42'C转化感受态大肠杆菌90秒，将转化后的大肠杆菌涂布在含有100"g/ml氨苄青霉素的LB平板上，将平板于37'C倒置培养过夜。次日挑取单克隆，在含有100ixg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB中37X:扩增培养16小时，取1. 5 ml菌液，12， 000 rpm离心30秒，去上清，以100 pl预冷的溶液Pl悬浮菌体。加入200 pl溶液P2，温和混匀，加入150 pl预冷的溶液P3 (溶液Pl，P2, P3的配制参见QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书)，混匀，12,000 rpm离心10分钟。取上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇溶液(体积比为25:24:1),剧烈混匀，12,000 rpm离心5分钟。取上层水相，加入两倍体积95%乙醇沉淀DNA。沉淀干燥后，溶解于20 pl含有20 pg/ml RNase A的TE(pH 8. O)溶液中，37'C水浴30分钟消化RNA,然后-20'C保存。
实施例3
人beclin 1基因启动子在L02人永生化肝正常细胞中的活性鉴定
细胞转染用超纯质粒的制备采用QIAGEN Plasmid Midi Kit并按供应商提供方法进行质粒柱纯化
1. 取25-50 ml培养过夜的菌液(即前述转化后的大肠杆菌)，6,000 rpm离心IO分钟，收集细胞；
2. 将沉淀重悬于4 ml Buffer PI (QIAGEN Plasmid Midi Kit提供)中，加入4 ml Buffer P2，轻轻颠倒混合，室温放置5分钟，加入4 ml预冷的BufferP3(QIAGEN Plasmid Midi Kit提供)，颠倒混匀，冰上放置15分钟；
3. 4°C， 20,000 g离心30分钟，立即移出含有质粒DNA的上清液；
4. 4°C， 20,000 g离心15分钟，立即移出含有质粒DNA的上清液；
5. 以4 ml Buffer QBT(QIAGEN Plasmid Midi Kit提供)平衡QIAGEN-tiplOO柱，液体在重力作用下流出；
6. 加入步骤4中的上清液使之靠重力流进介质，待液体流完后，用10mlBuffer QC(由QIAGEN Plasmid Midi Kit中提供)洗两次；
7. 加入5 ml Buffer QF(由QIAGEN Plasmid Midi Kit中提供)洗脱DNA，收集于新的离心管中；
8. 加入O. 7体积(3. 5 ml)异丙醇，混匀，20， 000 g 4°C离心30分钟，小心弃上清液，用75%乙醇清洗沉淀，15,000 g离心10分钟，弃上清液；
9. 风干后，将DNA溶解于适量无菌的去离子水中，琼脂糖凝胶电泳检测，并测0. D.值定量。
以2X107孔的密度接种L02细胞于6孔板中，24小时后按照Lipofectamine2000试剂的操作说明将已纯化的p(-644/+197) ， p(-277/+197)， p (-58/+197), p (-644/-59) ， p (+197/-644)质粒(1 u g/孔)和作为对照的pGL3-Basic空载体(1 U g/孔)分别和内参质粒pRL-nul1(0. 5 w g/孔)(购自Promega公司)一起转染细胞。转染24小时后，为细胞更换新鲜培养基。转染48小时后进行荧光素酶活性检测。荧光素酶活性测定采用Dual R印orter assay system试剂盒(购自Promega)，参照供应商提供的方法进行，试剂盒中的荧光素酶底物溶于10ml荧光素酶反应缓冲液H中，分装后-80'C冻存。使用前预先在室温下平衡半小时以上。终止试剂(St叩&Glo)临用前制备，将St叩&Gl0底物用St叩&Gl0缓冲液1/50稀释。细胞用PBS润洗后，每孔加入100 W 1X裂解缓冲液，室温放置IO分钟。悬液吸出后充分振荡混匀，于13,200 rpm离心2分钟，上清吸出检测荧光素酶活性。5 W上清液与25 W荧光素酶底物溶液混合，荧光计数器读数(L,)，向测量的混合液中加入25 W终止试剂，混合后荧光计数器读数(L2)。L, /L2的值为相应报告质粒的荧光素酶活性。上述所用各材料或溶液的配方可见试剂盒中提供的说明书。
实验结果如图l所示，p(-277/+197)的活性最强，比对照空载体的荧光素酶相对活性高出30倍以上。
p(-644/+197)的活性次之，说明在beclin 1启动子序列的-644/-277区域可能存在减弱子。
口(-58/+197)的活性更次，但相对空载体依然有显著性差异。
p(-644/-59)与空载体相比没有显著性差异，因此-58/+197区域包含了beclin 1启动子的核心区域。
口(-644/+197)有荧光素酶活性而？(+197/-644)没有，说明beclin 1启动子序列符合与启动子具有方向性这一一般规律。
实施例4
beclin 1启动子在H印G2和BEL-7404肝癌细胞中具有活性
将实施例2中得到的p(-644/+197)等质粒(1 w g/孔)和作为对照的pGL3-Basic空载体(1 U g/孔)分别与内参质粒pRL-null (0. 5 u g/孔) 一起按照实施例3所述转染BEL-7404细胞(人肝癌细胞，购自中科院细胞库)和H印G2细胞(人肝癌细胞，购自中科院细胞库)，并测定荧光素酶活性。
实验结果如图2所示，结果表明beclin 1启动子在H印G2和BEL-7404肝癌细胞中都具有活性。P(-277/+197)的活性与其它含有不同长度beclin 1启动子的表达载体相比仍然是最强的。在BEL-7404细胞(图2A)中，p(-277/+197)比对照空载体的荧光素酶相对活性高出15倍以上，在H印G2细胞(图2B)中，p(-277A197)比对照空载体的荧光素酶相对活性高出80倍以上。此外，通过常规PCR方法，本发明人还获得了对应于SEQ ID NO: 1序列 中第365-839位序列和第372-840位序列的启动子片段，将所述片段正向克隆 入pGL3-Basic载体上的Sacl酶切位点中，将重组载体转化H印G2和BEL-7404 肝癌细胞，检测所述启动子片段指导荧光素酶的表达活性。结果发现，所述启 动子片段指导荧光素酶的表达的能力与具有SEQ ID NO: 1中第368-841位序 列的启动子片段相当。
实施例5
beclin 1启动子在HEK-293T细胞中具有活性
将实施例2中得到的p(-644Al97)等质粒(ln g/孔)和作为对照的 pGL3-Basic空载体(1 " g/孔)分别与内参质粒pRL-null (0. 5 P g/孔) 一起按照 实施例3所述转染HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞，购自中科院细胞库)，并测 定荧光素酶活性。
实验结果如图3所示，结果表明beclin 1启动子在HEK-293T人胚胎肾细 胞中也具有活性。p(-277A197)的活性与其它含有不同长度beclin 1启动子 的表达载体相比仍然是最强的，比对照空载体的荧光素酶相对活性高出20倍 以上。
此外，通过常规的定点突变技术，本发明人还获得了对应于SEQ ID NO: 1 序列中第368-841位序列，且其中第369位由g变为c的启动子片段，将所述 片段正向克隆入pGL3-Basic载体上的Sacl酶切位点中，将重组载体转化 服K-293T细胞，检测所述启动子片段指导荧光素酶的表达活性。结果发现，所 述启动子片段指导荧光素酶的表达的能力与具有SEQ ID NO: 1中第368-841 位序列的启动子片段相当。
实施例6
beclin 1启动子在MCF7细胞中具有活性
将实施例2中得到的p(-644Al97)等质粒(1 u g/孔)和作为对照的 pGL3-Basic空载体(1 U g/孔)分别与内参质粒pRL-null (0. 5 u g/孔) 一起按照 实施例3所述转染MCF7细胞(人乳腺癌细胞，购自中国科学院细胞库)，并测 定荧光素酶活性。
实验结果如图4所示，结果表明beclin 1启动子在MCF7人乳腺癌细胞中
16也具有活性。p(-277/+197)的活性与其它含有不同长度beclin 1启动子的表 达载体相比仍然是最强的，比对照空载体的荧光素酶相对活性高出50倍以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院
<120〉 人自吞噬基因beclin 1启动子序列及其应用
〈160〉 3
〈170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 841
<212〉 DNA
<213〉 智人(Horao Sapiens)
〈400〉 1
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tgaggtggga cccttagaagggsgtctgggaaccctcacggctcttattggagtcccttec840 841
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉 引物
<400〉 2
agatctetgac gggatttaac cat 23
<210〉 3
<211> 17
18<212> DNA <213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature <223〉 引物
<400〉 3
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权利要求
1.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸序列选自下组(1)具有SEQ ID NO1中第(368±50)-(816±25)位所示序列的核酸序列；或(2)在严格条件下能够与(1)限定的核酸序列杂交且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸序列；(3)与(1)限定的核酸序列有95％以上同源性且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸序列；或(4)与(1)-(3)任一限定的核酸序列互补的核酸序列。
2. 如权利要求l所述的核酸，其特征在于，(l)项中，具有SEQ ID NO: 1中第(368±20)- (831 ± 10)位所示序列的核酸序列。
3. —种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的核酸，作为启动子元件。
4. 如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体是真核表达载体。
5. 如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。
6. 如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因包括自吞噬基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白。
7. —种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求3所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1所述的核酸以及与该核酸可操作地连接的目的基因。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞选自大肠 杆菌细胞、人永生化肝正常细胞L02、肝癌细胞H印G2、肝癌细胞BEL-7404、 人胚胎肾细胞HEK-293T、或人乳腺癌细胞MCF-7。
9.权利要求l所述的核酸的用途，其特征在于，所述的核酸用于作为启动 子元件，指导目的基因的高表达。
10. —种高表达目的基因的方法，其特征在于，所述的方法包括:(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；和(b) 从培养物中分离出目的蛋白。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种来源于自吞噬基因beclin 1启动子区域的启动子及其用途。本发明还公开了含有所述启动子的表达载体以及宿主细胞。本发明还公开了利用所述的启动子高表达目的基因的方法。本发明的启动子具有广泛的活性，在不同类型的宿主细胞中均能够指导目的基因高水平表达。
文档编号C12N15/12GK101514340SQ20081003370
公开日2009年8月26日 申请日期2008年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者红 唐, 徐振华, 栋 李, 颖 李, 李载平, 怡 毛, 亮 答, 赵慕钧 申请人:中国科学院上海生命科学研究院