水稻根特异表达启动子POsr1及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种水稻根部特异表达启动子POsr1及其应用，其核苷酸序列为：1)如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；或者2)在严格条件下与含有1)中的核苷酸序列杂交后具有启动子功能的核苷酸序列；或者3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列；或者4)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。该启动子可指导目的基因在植物根部特异性高表达，而在植物的其它组织低表达或不表达。本发明对于改善水稻的根系性状和驱动基因在根部特异表达，具有巨大的应用价值。
【专利说明】
水稻根特异表达启动子P〇sr1及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种水稻根特异表达启动子POsrl及其 应用。
【背景技术】
[0002] 植物根系作为重要的吸收物质的器官，能与±壤微生物相互作用、分泌抗病虫物 质W抵抗病菌对植物的侵袭。此外，根系能够在干旱、酸性条件及重金属等各种非生物胁迫 条件下，调整植物对各类物质的吸收保护地上部分。当与养分吸收和耐胁迫相关的基因被 特异的表达在根部组织后，植物则会在营养匿乏及胁迫条件下正常生长。物质被植物根的 吸收，是根的各类组织协调作用的结果。在根部、根毛和导管区均能特异表达的基因在植物 根部吸收物质的过程中发挥极其重要的作用。
[0003] 目前在植物中，虽然已有少数根部特异表达的启动子被克隆并应用于基因功能的 研究，但能够在水稻吸收营养的关键部位特异表达的启动子更少。发展更多的水稻等禾谷 科作物的根部特异型启动子对基础性研究和遗传改良应用都具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供水稻根部特异表达启动子POsrl，可指导目的基因在植 物根部特异性高表达，而在植物的其它组织低表达或不表达。
[0005] 本发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（OiTza sativa L cv.Nipponbare) P0sRo3基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DM序列，并将其命名为启动子POsrl。
[0006] 启动子POsrl的核巧酸序列为：
[0007] 1)如SEQ ID No: 1所示的核巧酸序列;或者
[000引2)在严格条件下与含有1)中的核巧酸序列杂交后具有启动子功能的核巧酸序列； 或者
[0009] 3)与1)或2)限定的核巧酸序列具有95% W上的同源性，且具有启动子功能的核巧 酸序列;或者
[0010] 4)在SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列中取代、缺失或添加一个或多个核巧酸后 所获得的具有启动子功能的核巧酸序列。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一组扩增上述的水稻根特异性表达启动子POsrl的全 部或其任意片段的引物对。所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核巧酸 序列如SEQ ID N0:2所示，所述反向引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种含有所述水稻根部特异表达启动子POsrl的重组 表达载体。所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的水稻根部特异表 达启动子POsrl得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻根部特异表达启动子 POsrl连接于载体中待表达基因序列的上游。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种含有所述水稻根部特异表达启动子POsrl的表达 盒。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种含有所述启动子POsrl的宿主菌。获取用于转基 因植物培育的宿主菌的方法，包括将所述的水稻根部特异表达启动子POsrl、所述的重组表 达载体、或所述的表达盒转入根癌农杆菌。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种所述的启动子POsrl在植物根特异性表达中的应 用。本发明所述"植物"是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水 稻。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，包括 将所述水稻根部特异表达启动子POsrl转入大肠杆菌感受态细胞中，经菌落PCR筛选获得阳 性克隆，将所获得的阳性克隆和植物载体构建植物表达载体，再将所述植物表达载体转入 根癌农杆菌，并利用所述根癌农杆菌通过介导方法获得转基因植物细胞、组织、器官或植 株。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种所述的水稻根部特异表达启动子POsrl在培育转 基因植物中的应用，包括:将所述的水稻根部特异表达启动子POsrl连接于载体中待表达基 因序列的上游，从而构建重组表达载体;将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官 中进行培育。所述待表达基因为具有改善水稻根性状能力的基因。
[0018] 本发明的启动子POsrl序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可W与所需的祀标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，可驱 动祀标基因在植株根部中特异性表达，从而提高外源祀标基因在植物根中的表达量，增加 转基因的效果。
[0019] 在一个【具体实施方式】中，将该启动子POsrl序列经酶切后连接到植物双元表达载 体PCAMBIA1305上，获得相应的重组表达载体，利用该重组表达载体转化根癌农杆菌菌株 EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。
[0020] 对获得的转基因水稻进行GUS组织化学染色检测发现，转基因植株的根特别是根 部GUS基因显著表达，而其他部位如茎叶等中均没有明显的GUS活性，从而证明该启动子具 有驱动基因在根部特异性表达的活性。
[0021] 本发明所克隆的水稻启动子POsrl能够调控基因特异性的在植株根部表达，在实 际应用中具有显著价值。在基因工程中，使用该启动子可W通过组织特异性表达精确控制 植物生物反应器细胞中目标基因的表达时机和强度，同时，利用该启动子对农作物品种进 行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可W提高和改善水稻根部对各 类物质的吸收。
[0022] 本发明启动子POsrl对于水稻根相关的研究具有重要的理论及实际意义，在农业 领域将具有广阔的应用和市场前景，尤其是对于改善水稻的根系性状和驱动基因在根部特 异表达，具有巨大的应用价值。
【附图说明】
[0023] 图1为PCR扩增启动子POsrl的电泳图；
[0024] 图2为启动子POsrl序列的克隆鉴定图，其中：
[00巧]A:菌落PCR鉴定，M:DNAMarker 2000;l-10:P0srl菌落PCR产物；
[0026] B:质粒双酶切检测，M:DNA Marker 2000; 1-2: pGM-T-POsrl载体双酶切后的POsrl 基因片段；
[0027] 图3为pCAMBIA1305-P0srl载体示意图，其中示出了利用Posrl启动子驱动位于其 下游的GUS基因活性的LAC表达；
[0028] 图4为pCAMBIA1305-P0srl表达载体的鉴定，其中：
[00巧]A:菌落PCR鉴定，M:DNA Marker 2000;l-12:P0srl菌落PCR产物；
[0030] B:pCAMBIA1305-P0srl载体双酶切检测，M:DNA Marker 2000;l-8:pCAMBIA1305- POsrl载体双酶切后的POsrl基因片段；
[0031] 图5为pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻PCR检测电泳图，M:DNAMarker 2000;1-10: pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻GUS报告基因 PCR产物；
[0032] 图6为pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻GUS染色结果一生长7天的水稻；
[0033] 图7为pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻GUS染色结果一孕穗期叶片；
[0034] 图8为pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻GUS染色结果一孕穗期颖壳；
[0035] 图9为pCAMBIA1305-P0srl转基因水稻GUS染色结果一孕穗期根。
【具体实施方式】
[0036] W下通过具体实施例对本发明进行详细的说明。下述实施例中的实验方法，如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为 市售购买产品。
[0037] 实施例1启动子POsrl的克隆及重组载体的构建
[0038] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（0;ryza sativa L cv.Ni卵onbare)全基因组 序列，依据水稻Posrl基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及祀标基因的特点，设 计引物的酶切位点。
[0039] 步骤1水稻基因组DNA的提取
[0040] W日本晴叶片为材料，用天根生物植物总DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取 水稻基因组DNA。
[0041 ] 步骤2PCR扩增及测序
[0042] W水稻品种日本晴基因组DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsrl， 引物序列，POsrlF 引物：GGTACCGCGGTGGTGGATGTGAAG;POsrlR 引 物： TGCAACCATACAAGGCCAAAGCTT，按常规PCR体系，采用如下扩增程序:95 °C预变性5min; 95 °C变 性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min30s，循环35次;最后72°C延伸lOmin。回收PCR扩增的目 的片段，如图1所示。
[00创将目的片段连接至化GEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例 混合)上，按照热激法转化大肠杆菌化-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的 片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，如图2所示，挑取单 克隆摇菌液提质粒，用化ndn I和kpnl限制性内切酶酶切，如图3所示，酶切片段大小与目标 片段一致，将经过鉴定的阳性克隆送交Invi化ogen公司测序。验证即为所要获得的启动子 Posrl片段，其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。回收启动子POsrl片段。
[0044] 步骤3重组表达载体pCAMBIA1305-Posrl的构建
[0045] 利用Hindlll和kpnl对PCAMBIA1305进行线性化处理、回收PCAMBIA1305,将步骤2 得到的POsrl片段和PCAMBIA1305片段用T4连接酶(购于化KaRa公司）进行连接，得到启动子 POsrl与GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1305-P0srl。
[0046] 将质粒进行酶切鉴定，如图4。其结果与POsrl基因一致。表明确定PCAMBIA1305- POsrl载体构建正确。
[0047] 实施例2农杆菌介导的水稻遗传转化
[004引利用冻融法将植物表达载体pCAMBIA1305-P0srl转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
[0049] 成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子Imin，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50%次氯酸钢(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min( 15化/min)。倒掉次氯酸 钢，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钢味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊 粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽 分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌转化。
[0050] 采用上述过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化， 共获得15株pCAMBIA1305-P0srl植株（Posrl: :GUS转基因水稻植株），如图5所示，依据 P C A M B I A 1 3 0 5 - P 0 S r 1载体特异序列设计检测引物，引物序列如下，F : CACTATTAACGGGTATGTCG、R:ATTGCCCTTTGGTCTTCT经PCR鉴定，扩增片段与目标片段大小一 致。该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan， Chengu曰ng Zh曰i，et 曰l.An efficient 曰nd high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.)[J].Plant Cell Report， 2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
[0051] 实施例3转基因水稻苗中启动子的特异表达
[0052] 将实施例2转化了启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎(銷）和叶分别进行 GUS染色:将各组织分别浸于GUS染色液中，37°C，过夜24小时，75%乙醇脱色，将组织中的叶 绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图6所示，在7天的转基 因幼苗中，代表GUS表达的蓝色在叶、茎(銷）组织中没有没有出现；而在根中Posr巧区动的 GUS集中在根部集中表达，图7-9所示在转基因水稻孕穗期的材料发现，只在根中有较强表 达，在叶和颖壳中几乎无表达，运表明化srl启动子是根部特异表达启动子。
【主权项】
1. 一种水稻根部特异表达启动子POsr 1，其特征在于其核苷酸序列为： 1) 如SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列；或者 2) 在严格条件下与含有1)中的核苷酸序列杂交后具有启动子功能的核苷酸序列;或者 3) 与1)或2)限定的核苷酸序列具有95%以上的同源性，且具有启动子功能的核苷酸序 列;或者 4) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸后所获 得的具有启动子功能的核苷酸序列。2. -组扩增权利要求1所述核苷酸序列的全部或其任意片段的引物对。3. 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所 示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。4. 一种含有权利要求1所述核苷酸序列的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于为在植物表达载体的多克隆位点 插入权利要求1所述的核苷酸序列得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达 基因序列的上游。6. -种含有权利要求1所述核苷酸序列的表达盒。7. -种含有权利要求1所述核苷酸序列的宿主菌。8. -种权利要求1所述的启动子POsrl在植物根特异性表达中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物。10. -种权利要求1所述的启动子POsrl在培育转基因植物中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK106047878SQ201610662701
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610662701.0, CN 106047878 A, CN 106047878A, CN 201610662701, CN-A-106047878, CN106047878 A, CN106047878A, CN201610662701, CN201610662701.0
【发明人】汪启明, 饶力群, 朱建华, 骆鹰, 张超, 谢旻
【申请人】湖南农业大学