一种海水微生物宏基因组的提取方法

一种海水微生物宏基因组的提取方法
【专利摘要】本发明提供一种海水微生物宏基因组的提法方法。本发明针对海水这一特殊的样本给予去盐离子处理、双重滤膜过滤再回收处理相结合，旨在提供一种高效、快速的提取海水微生物宏基因组的方法，具体包括以下几个步骤：海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱。本发明能够有效的去除海水中较多的盐离子的干扰；充分裂解海水中的微生物细胞，使DNA充分释放。本发明方法提取的DNA，其A260/280比值维持在1.8?2.0之间，所得DNA质量好、纯度高；能够满足基因文库构建和qPCR以及高通量测序的需求，为研究微生物基因组遗传变异多样性提供了良好的基础。
【专利说明】
-种海水微生物宏基因组的提取方法
技术领域
[0001] 本发明提供一种海水微生物宏基因组的提取方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 海水微生物是生物活性物质的重要源泉。海洋环境的特殊性W及海洋生物物种间 复杂的相互作用赋予了海洋微生物有别于陆生生物的新陈代谢途径和适应机制，从而产生 新的遗传特异性，合成结构独特、具有特定生物活性的次级代谢产物。运些结构异常、作用 特殊的活性物质是陆栖微生物所无法比拟的。20世纪W来，人们一直采用分离培养的方法 来研究海水微生物的多样性。即将海水微生物从环境中分离纯化，然后通过实验室培养的 手段进行后续的研究。
[0003] 然而随着研究的深入，发现很多微生物不能够培养繁殖，给进一步的分子生物学 研究提出了新的难题。但近年来分子生物学手段的飞速发展使海洋微生物的研究进入了新 的领域，摆脱了对传统培养技术的依赖。特别是新一代测序技术的兴起，使微生物基因组的 研究延伸到了前所未有的领域。二代测序特别适合微生物实验室，因其基因组小，且数据分 析相对简单；与其他实验室方法相比极具吸引力。序列检测的结果可直接关联到基因组位 点，有利于分析该位点可能带来的生物学影响；另外，我们能够测定基因组中的单个碱基的 变化，W追踪微生物在短期内对环境的适应性。例如，全球流行病的蔓延往往需要几年的时 间来追踪，有了单碱基分辨率的细菌基因组新一代测序，有望在几周内快读追溯到局部地 区人群、医院甚至家庭中的流行病原因。而提取海水微生物DNA是开展关于海水微生物研 究、开发、利用的基础。但海水微生物含有大量的无机盐离子、无机化合物及有机化合物、重 金属离子等干扰提取反应进行的杂质。且不同水域的海水微生物种类不同，运都为从海水 微生物群中提取DNA带来了困难。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种高效、快速的海水微生物宏基因组的提法方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种海水微生物宏基因组的提法方法，包括海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、 DNA的游离与吸附、DNA洗脱等步骤。所述海水微生物宏基因组的提取步骤如下： (1) 海水中杂质的去除:海水样本中按照2%的质量体积比加入a-纤维素，常溫下，静置 0.5 h;将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压累，将海水样本倒入过滤器 上方，打开负压累电源，执行过滤;然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤;把两种滤 膜都进行收集;将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1 min,然后置于室溫下90 S，如此反复 冻融5次； (2) 海水微生物的裂解:将滤膜剪碎置于5 ml离屯、管中，再加入250 iil细胞裂解液、40 浓度为20 mg/ml的溶菌酶W及10 iil浓度为2 mmol/L的邸TA;将反应液置于56 °C水浴锅 中解育10 min,期间每隔5 min震荡一次;然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、 120000 g离屯、15 min;取上清至干净的2 ml离屯、管中； (3) DNA的游离与吸附:往上清液中加入250山浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头 混匀；12000 Og离屯、5 min,然后小屯、取上清至新的2 ml离屯、管中；往离屯、管中加入等体积 的酪:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离屯、3 min,将上清转移至吸附柱中；将吸附 柱置于离屯、管中，14000 g离屯、5 min,弃掉收集管中的废液； (4) DNA洗脱:往离屯、柱中加入70%的乙醇750 yl，然后12000 g离屯、3 min,弃收集管中 的废液;再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离屯、5 min，弃掉收集管中的废液;然后加入成 分为 10 mmol/L的lYis-CKl mmol/L的抓TA、pH=8.0的DNA洗脱液80 yl;14000 g离屯、5 min，收集离屯、管中的DM洗脱液，测定浓度。
[0006] 本发明的优点在于： 首先，有效去除了盐离子等杂质干扰并提高了 DNA的浓度。本发明针对海水运一特殊的 样本，给予去盐离子处理、双重滤膜过滤再回收处理两步结合的方法，旨在提供一种高效、 快速的提取海水微生物宏基因组的方法。采取两步结合法一方面能够有效的去除海水中较 多的盐离子的干扰，使DNA的A260/280的纯度维持在1.8-2.0之间。另一方面双重过滤双回 收能够浓缩样本浓度达到加快实验速率W及最大限度的提高DNA浓度的效果。盐离子的处 理是在海水中加入2%的a-纤维素;a-纤维素能够有效的与海水中化C〇3、Mg(OH)2等悬浮的杂 质颗粒交联，形成较大的凝体而沉淀从而避免海水中杂质的影响。
[0007] 其次，本发明将海水微生物细胞充分裂解，DNA得W释放。此外由于海水微生物和 其他物质种类繁多，不仅含有革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌还有真菌、隧菌体、病菌等。如何 有效且充分的将其裂解，释放出DNA物质是关键。本实验采用冻融法和酶溶法相结合的处理 方式，一方面能够有效的避免采用机械处理方式带来的非专一性，碎片破碎大小不一的缺 点。另一方面由于使用滤膜过滤时，传统的方法要求必须置于-80 °C过夜，使得实验耗时 长;采用冻融法后一方面能够直接处理样本，减少-80 °C过夜的繁琐步骤，此外能够在一定 程度上破碎细胞，提高后续抽提的效率和收率。在裂解细胞壁的时候，传统的方法一般仅仅 使用溶菌酶;本发明中使用的溶菌酶需和抓TA混合使用，一方面溶菌酶能够有效的裂解革 兰氏阳性菌细胞壁，但是对革兰氏阴性菌裂解效果较差，必须加馨合剂才能将革兰氏阴性 菌细胞壁有效的破除。通过运样的组合可W同时破除两种细胞壁，简单有效。
【具体实施方式】
[000引图1为不同海水样本基因组的16S rDNA的V3-V4区PCR扩增电泳图。其中M泳道为 DNA Marker; H1-H4分别为不同海水样本基因组模板的PCR产物。 实施例
[0009] -种海水微生物宏基因组的提取方法，首先取得海水样本并进行预处理，然后提 取其微生物宏基因组。具体的步骤包括： (1)海水中杂质的去除:海水样本中按照2%的质量体积比加入a-纤维素，常溫下，静置 0.5 h;将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压累，将海水样本倒入过滤器 上方，打开负压累电源，执行过滤;然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤;把两种滤 膜都进行收集;将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存Imin，然后置于室溫下90 S，如此反复冻 融5次； (2) 海水微生物的裂解:将滤膜剪碎置于5 ml离屯、管中，再加入250 iil细胞裂解液、40 浓度为20 mg/ml的溶菌酶W及10 iil浓度为2 mmol/L的抓TA;将反应液置于56°C水浴锅 中解育10 min,期间每隔5 min震荡一次;然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、 120000 g离屯、15 min;取上清至干净的2 ml离屯、管中； (3) DNA的游离与吸附:往上清液中加入250山浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头 混匀；120000 g离屯、5 min,然后小屯、取上清至新的2 ml离屯、管中；往离屯、管中加入等体积 的酪:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离屯、3 min,将上清转移至吸附柱中；将吸附 柱置于离屯、管中，14000 g离屯、5 min,弃掉收集管中的废液； (4) DNA洗脱:往离屯、柱中加入70%的乙醇750 yl，然后12000 g离屯、3 min,弃收集管中 的废液;再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离屯、5 min，弃掉收集管中的废液;然后加入成 分为 10 mmol/L的lYis-CKl mmol/L的抓TA、pH=8.0的DNA洗脱液80 yl;14000 g离屯、5 min，收集离屯、管中的DM洗脱液，测定浓度。
[0010] 将提取所得DNA洗脱液使用化no化op 2000测定的DNA浓度，本发明（试验组)与常 规方法(对照组)提取海水微生物宏基因组的效果分别如表1所示。从表1可W看出按照本发 明方法提取的DNA浓度高于常规方法提取所得基因组浓度，可满足测序、PCR反应等分子生 物学操作的浓度要求;其次，A260/280的比值均位于1.8-2.0范围内，说明本发明提取所得 DNA纯度高，表明本发明提取海水微生物宏基因组提取率高且提取提取效果良好。
[0011] 表1两种方法提取海水微生物宏基因组效果对比
W所提宏基因组DNA洗脱液为模板进行PCR反应扩增16s rDNA V3-V4区，并进行琼脂糖 凝胶电泳验证，排除其他动植物的干扰。其中16S rDNA V3-V4引物为： 319F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ' 806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' W上述两组基因组为模板进行PCR扩增，所得16S rDNA V3-V4片段PCR产物琼脂糖凝胶 电泳验证结果见图1。图1显示试验组PCR扩增产物条带单一、长度符合预期值且条带比对照 组亮，说明PCR过程特异性高、扩增效果好，满足后续分子生物学研究使用。试验组的PCR效 果也更优于对照组。该结果进一步论证了本发明达到了理想的技术效果。
[0012] 所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于:所述提取方法包括如下步骤:海 水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱。2. 根据权利要求1所述的一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于:包括如下 步骤： (1) 海水中杂质的去除：海水样本中按照2 %的质量体积比加入α-纤维素，常温下，静 置0.5 h;将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压栗，将海水样本倒入过滤 器上方，打开负压栗电源，执行过滤;然后更换〇. 2 um的滤膜对滤液进行再次过滤;把两种 滤膜都进行收集;将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1 min，然后置于室温下90 s，如此反 复冻融5次； (2) 海水微生物的裂解:将滤膜剪碎置于5 ml离心管中，再加入250 μL细胞裂解液、40 μL浓度为20 mg/ml的溶菌酶以及10 μL浓度为2 mmol/L的EDTA;将反应液置于56 °C水浴锅 中孵育10 min，期间每隔5 min震荡一次;然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、 120000 g离心15 min;取上清至干净的2 ml离心管中； (3) DNA的游离与吸附：往上清液中加入250 μL浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头 混匀；120000g离心5min，然后小心取上清至新的2 ml离心管中；往离心管中加入等体积的 酸:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提;14000 g离心3 min，将上清转移至吸附柱中；将吸附柱 置于离心管中，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液； (4) DNA洗脱:往离心柱中加入70%的乙醇750 μL，然后12000 g离心3 min，弃收集管中 的废液;再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液;然后加入成 分为 10 mmol/L的Tris-Cl、l mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脱液80 μ1;14000 g离心5 min，收集离心管中的DNA洗脱液，测定浓度。3. 根据权利要求2所述的一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于:所述细胞 裂解液成分为：150 mmol/L NaCl、l% vol的NP-40、0.5% w/v的脱氧胆酸钠、0.1% w/v的SDS 和50 mmol/L的Tris，pH=8·0〇
【文档编号】C12N15/10GK106047869SQ201610706216
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月23日
【发明人】李珊, 谢文龙, 刘青青, 王松林, 陈荣山, 肖辛野, 李奇渊, 姚迅
【申请人】厦门基源医疗科技有限公司