由免疫复合物直接对微生物进行测序的测定法与方法

由免疫复合物直接对微生物进行测序的测定法与方法
【专利摘要】本文提供了用于在患者样品中对免疫刺激性微生物进行检测和/或识别的MiIP-Seq测定法和方法。本文还提供了用于对感染性疾病进行诊断或在患者样品中对先前未特征化的微生物进行识别的方法。本文所述的方法和测定法相对于现有方法的优势在于：（i）不需要用于微生物扩增的培养步骤；（ii）并非特异性针对特定微生物，可用于对先前未特征化的微生物进行识别；以及（iii）由于不进行微生物培养步骤，因此允许快速处理。
【专利说明】由免疫复合物直接对微生物进行测序的测定法与方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求2011年I月26日提交的美国临时专利申请序列N0.=61/436, 345的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明的【技术领域】涉及免疫系统刺激性微生物的检测和识别，以及感染性疾病的诊断。
[0004]政府支持
[0005]本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的NIH DK44319的政府支持下作出的。美国政府对本发明享有一定的权利。
【背景技术】
[0006]据估计，有一百万美国人患有慢性炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)o IBD，如 Crohn’ s 病(CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。这些疾病以导致肠内膜(intestinal lining)组织受损的慢性炎症性响应为特征。⑶和UC两者均显出大量迁移至粘膜并进入肠腔的白细胞。两种疾病均在疾病活性中的活性阶段(即，存在肠炎)和非活性阶段(即，最低限度的肠炎至无肠炎)之间交替。活性IBD可包括如出血性腹泻、腹痛和发热等症状。非活性阶段具有最低限度的肠炎至无肠炎，且无严重的胃肠病。已经具有下列假定:对共生细菌(co_ensal bacteria)的不当免疫响应是炎症性肠病的起因之一。不当免疫响应可导致形成免疫复合物，例如，抗体分子和抗原的组合。抗原可以为外来物质，如病毒或细菌多肽。抗体可以通过包覆病毒或细菌来防止感染。

【发明内容】

[0007]本文所述的测定法和方法提供了检测和/或识别微生物的直接方法，先天性免疫系统或适应性免疫系统的一种或多种组分对所述微生物产生响应。此类方法的独特之处在于其确定何种微生物被免疫系统识别为外来抗原的能力，而非单纯检测微生物的存在。由于许多微生物可以在不导致疾病的情况下存在(例如，共生细菌)，因此检测微生物水平并不一定表明某微生物对于检出该微生物的受试者来说是病原性的。然而，本文所述的方法允许对如下微生物进行检测:受试者机体对该微生物产生免疫响应,这些方法在本文中被称为“微生物免疫沉淀和测序(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)”法或者“MilP-Seq”法。这一区别对于一些情况来说可以是尤其重要的，例如，对于这样的疾病尤其重要:在该疾病中，对个体的子集中的特定抗原产生免疫响应，而这一反应在群体中的多数个体中并不出现(例如，对于患有自身免疫病症的个体)。另一个实例包括炎症性肠病(IBD),所述疾病被认为在一些情况下由对共生微生物群(commensal microbiota)产生的不当免疫响应导致。相应地,本文所述的测定法和方法在一些实施方式中允许对在例如患有免疫性肠病的受试者中特异性引发免疫响应的共生微生物群(包括细菌、病毒和其它微生物)进行检测和/或识别，并允许对感染性疾病进行诊断。
[0008]相应地，本文提供了用于对患者样品中的免疫刺激性微生物进行检测和/或识别的测定法和方法。本文还提供了用于对感染性疾病进行诊断或对患者样品中的新型病原体进行识别的方法。
[0009]相应地,在一些方面,本文提供了用于在患有疾病或失调(disorder)的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括如下步骤:(a)由从患者样品获得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；(b)对提取的核酸进行测序；以及(C)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，则患者被检测为具有免疫刺激性微生物。在一些方面，本文提供了用于在患有疾病或失调的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括如下步骤:(a)由患者样品制备免疫蛋白富集部分；(b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；(c)对所述提取的核酸进行测序；以及(d)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，则患者被检测为具有免疫刺激性微生物。 [0010]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，患有疾病或失调的患者患有炎症性肠病。在一些此类实施方式中，所述炎症性肠病为Crohn’ s病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎(collagenous colitis)、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、Behcet’ s 综合征、或未定型结肠炎(indeterminate colitis)。
[0011]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，患有疾病或失调的患者患有自身免疫失调。
[0012]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，患有疾病或失调的患者患有硬化(cirrhosis)、败血症(sepsis)或病毒血症(viremia)。
[0013]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白(complement protein)或病原体识别受体(pathogenrecognition receptor)的特异性亲和结合剂制备。
[0014]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的特异性亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
[0015]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
[0016]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。
[0017]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任意组
八
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[0018]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，在所述方法中使用的亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体,或所述亲和结合剂或抗体的任意组合。[0019]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述方法中使用的亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0020]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述方法中使用的亲和结合剂未结合至固相载体。
[0021]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述方法中使用的亲和结合剂结合至固相载体。在一些此类实施方式中，所述固相载体包括超顺磁微珠(superparamagnetic microbeads)、微尺度琼月旨糖珠(microscopic agarose beads)、或琼脂糖树脂珠(agarose resin beads)。
[0022]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
[0023]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
[0024]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，患者样品为血液样品、血衆样品、尿样品、脑脊液(cerebrospinal fluid)样品、粘膜(mucous membrane)样品、粪便(fecal)样品、肠灌洗(intestinal lavage)样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰(respiratory sputum)样品、或支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)样品。在一些此类实施方式中，肠灌洗样品为回肠灌洗(ileal lavage)样品。
[0025]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物为先前未特征化(uncharacterized)的微生物。
[0026]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆(shotgun cloning)、16S rRNA/DNA扩增和/或宏基因组(metagenomic)测序进行。
[0027]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，使用微生物基因特异性引物进行步骤(b)或步骤(c)的测序。
[0028]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，使用非基因特异性引物进行步骤(b)或步骤(c)的测序。
[0029]在本文所述的这些方法和全部此类方法的一些实施方式中，制备免疫蛋白富集部分的患者样品在提取核酸的步骤之前不进行培养步骤。
[0030]此外，在一些方面，本文还提供了一种在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括以下步骤:(a)由从患者样品制备的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(b)对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
[0031]在一些方面，本文还提供了一种在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括以下步骤:(a)由患者样品制备免疫蛋白富集部分；(b)从所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(c )对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
[0032]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白或病原体识别受体具有特异性的亲和结合剂制备。
[0033]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特异性的亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
[0034]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
[0035]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。在一些此类实施方式中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任
意组合。
[0036]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所使用的亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体。
[0037]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所使用的亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0038]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所使用的亲和结合剂未结合至固相载体。在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所使用的亲和结合剂结合至 固相载体。在一些此类实施方式中，所述固相载体包括超顺磁微珠、微尺度琼脂糖珠、或琼脂糖树脂珠。
[0039]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
[0040]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
[0041]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，患者样品为血液样品、血浆样品、尿样品、脑脊液样品、粘膜样品、粪便样品、肠灌洗样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰样品、或支气管肺泡灌洗液样品。在一些此类实施方式中，所述肠灌洗样品为回肠灌洗样品。
[0042]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，被检测的免疫系统刺激性微生物为先前未特征化的微生物。
[0043]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆、16S rRNA/DNA扩增和/或宏基因组测序进行。
[0044]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，使用微生物基因特异性引物进行步骤(b)或步骤(c)的测序。
[0045]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，使用非基因特异性引物进行步骤(b)或步骤(c)的测序。
[0046]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，制备免疫蛋白富集部分的患者样品在提取核酸的步骤之前不进行培养步骤。
[0047]在本文所述的这些测定法和全部此类测定法的一些实施方式中，微生物不能使用标准培养条件进行培养。[0048]在一些方面，本文还提供了用于从至少一个测试样品获取数据的系统，所述测试样品包含由免疫蛋白富集样品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集样品由至少一名患者处获得，所述系统包含:测定模块，其被配置为接收包含所述提取的核酸的所述至少一个测试样品，并对所述至少一个测试样品进行至少一次测序分析，以产生测序数据输出；存储装置，其被配置为存储来自所述测定模块的所述测序数据输出；比较模块，其被配置为接收包含所述提取的核酸的测试样品的所述测序数据输出，并对所述测序数据输出进行至少一次序列分析，从而确定下列条件之一存在与否，并产生比较数据输出:(i )所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上、或(ii)所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20%;以及显示模块，其用于对部分基于来自所述比较模块的所述比较数据输出的内容进行显示，其中，所述内容包括表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上的信号、或表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信号。[0049]在本文所述的这些系统和全部此类系统的一些实施方式中，所述显示模块上显示的内容进一步包括表明建议接受特定治疗方案的患者的信号。
[0050]定义
[0051]为了方便起见，将本文在说明书、实施例和所附的权利要求中所使用的特定术语收集于此。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除在其所属领域已具有的含义。提供所述定义以辅助描述【具体实施方式】，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有与本发明所属【技术领域】中的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0052]本文所使用的术语“炎症性肠病(IBD)”包括任意类型、病因或病机(etiology orpathogenesis)的炎症性肠病。其包括但不仅限于:溃瘍性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉型结肠炎(colitispolyposa)、透壁性结肠炎(transmural colitis)、节段性结肠炎(segmentalcolitis)、Crohn’ s病、未定型结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet’ s综合征、感染性结肠炎等。
[0053]本文所使用的术语“自身免疫疾病”是指免疫介导的、源于自身组织受攻击的病症，其中，受试者的自身抗体与宿主组织反应，或免疫效应因子T细胞与内源性自身肽发生自体反应并引起组织破坏，但也可涉及对微生物的免疫响应。此类病症包括但不仅限于:自身免疫性糖尿病(I型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病)、ANCA阳性血管炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、Sjogren’ s病或综合征、皮肌炎、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、多发性硬化、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、Hashimoto’ s 甲状腺炎、Goodpasture’ s 综合征、天疱疮(pemphigus)(例如，寻常天疱疮(pemphigus vulgaris))、Grave’ s病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎、恶性贫血(pernicious anemia)、特发性Addison’s病、自身免疫相关性不孕不育(autoimmune-associated infertility)、肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎(crescentic glomerulonephritis)、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、肾小球肾炎、以及Guillain-Barre综合征。在一个实施方式中，自身免疫性疾病选自由如下疾病所组成的组:多发性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲状腺炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球肾炎、Guillain-Barre综合征、牛皮癣和重症肌无力。
[0054]本文所使用的术语“直接检测”是指本文所述的方法在如下方面的能力:直接从免疫蛋白富集部分测定微生物的存在和类别(identity)(例如，通过测序)，而无需使用用于对微生物进行间接测试(如针对微生物的IgG ELISA)的测定法。本文所述的方法采用“直接检测”，该“直接检测”具有如下附加优势:通过利用对微生物的先天性和/或适应性免疫响应，能够以无偏倚的方式识别先前未特征化的微生物。这在某些情况下是非常有用的，例如，当抗微生物的IgG抗体未知时、当微生物无法使用标准技术培养以增强检测时、和/或当没有抗微生物抗体的现有ELISA测试时。
[0055]本文所使用的术语“免疫系统刺激性微生物”是指细菌、真菌或病毒，所述微生物由受试者的先天性或获得性免疫系统识别，从而在受试者产生针对该微生物的免疫介导的响应。免疫系统刺激性微生物可以来自分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。通常，如在本文中定义的术语，免疫系统刺激性微生物是“致病的”，然而在一些情况下，典型的非致病性微生物(例如，共生细菌)仍然可以在受试者群体的子集(如患有炎症性肠病的受试者)中产生免疫介导的响应。因此,术语“免疫系统刺激性微生物”在本文中不与“致病的”互换使用。在一个实施方式中，免疫刺激性微生物不为马病原体，如里氏埃里希氏体(Ehrlichia risticii)。
[0056]本文所使用的术语“患者样品”或“生物样品”指的是从患者处获得的流体样品、细胞样品、组织样品或器官样品。在一些实施方式中，从受试者处获得细胞或细胞群、或一定量的组织或体液。“患者样品”经常可包括来自动物的细胞，但该术语也可以指非细胞的生物材料，如可用于检测微生物的存在或类别的血液、唾液或尿液的非细胞部分。生物样品包括但不仅限于:活组织切片、刮取物(如口腔刮取物)、全血、血浆、血清、尿液、唾液、细胞培养物、活组织切片、粘膜样品、粪便、肠灌洗物、关节液、脑脊液、胆汁样品、呼吸道分泌物(如痰)、支气管肺泡灌洗液样品等。生物样品或组织样品可以指由个体分离的组织或流体，包括但不仅限于，例如，血、血浆、血清、尿、粪便、痰、脊髓液、胸膜液(pleural fluid)、淋巴液；皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外层；眼泪、唾液；和器官。样品可包括冷冻组织。术语“样品”还涵盖任何由对此类样品进行进一步加工而衍生的材料。衍生样品可包括例如由样品提取的核酸或蛋白；或经由将所述样品进行如核酸扩增或mRNA逆转录，或对特定核酸、蛋白、其它细胞质组分或核组分进行分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白。
[0057]术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，特别是人，对于所述受试者，期望对由其获得的生物样品中免疫系统刺激性微生物的存在进行分析。在一些实施方式中，受试者需要对疾病或失调进行诊断，例如对炎症性肠病进行诊断，其中，使用本文所述的测定法和方法对生物样品进行分析。本文所使用的术语“受试者”或“患者”还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在一个实施方式中，所述受试者为人。在一些实施方式中，所述受试者不是马。
[0058]本文所使用的术语“免疫蛋白富集部分”是指部分纯化(例如，通过免疫沉淀)的样品，所述部分纯化使得期望的免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、补体、或先天性或适应性免疫响应的其它可溶性/循环组分)在样品中的水平与衍生所述样品的初始患者样品相比提高至少10%。在一些实施方式中，与衍生所述样品的患者样品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。
[0059]本文所使用的术语“免疫球蛋白”是指通常存在于受试者血液或其它体液中的抗体，被用于识别和中和外来抗原(如细菌或病毒)。通常，免疫球蛋白包含两条大的重链和两条小的轻链，并且由白血细胞制造。哺乳动物中已知存在五种不同的抗体同种型(isotype)(BP, IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，其各自发挥不同的作用，并帮助针对遇到的各个不同类型的外来对象引导适当的免疫响应。
[0060]本文所使用的术语“抗体”是指由免疫系统产生的蛋白(保护有机体不受抗原的作用)及其天然存在的变体。“抗体”通常包含彼此间通过二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链均由重链可变区和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链均由轻链可变区和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链可变区和轻链可变区可进一步细分成高可变区(称作互补决定区(⑶R))，散布于较保守的区域(称为框架区(FR))之中。每条可变重链和可变轻链由3个⑶R和4个FR组成，由氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和经典的补体系统的第一组分(Clq)。
[0061]本文所使用的术语“先前未特征化的微生物”是指具有未知功能的微生物或先前未曾识别或测序的新型微生物。根据本文所述方法的实施方式，使用随机引物对此类微生物进行测序。随后将序列与已知的微生物序列(例如，微生物序列数据库，如GenBank或宏基因组文库数据库)进行比较，从而允许识别(例如，使用搜索引擎(如BLAST)或比对工具(如ClustalW))。例如，如果与数据库中的另一微生物同源性很低或没有同源性(例如，低于20%),则被识别为先前未特征化的微生物。在一些实施方式中，先前未特征化的微生物将与数据库中的微生物 具有序列同源性，然而数据库并未表明微生物的功能是已知的。
[0062]本文所使用的短语“不进行培养步骤”表示在对核酸进行提取和测序前，并未使用标准技术对免疫蛋白部分进行培养以扩增样品中的微生物数量。
[0063]本文所使用的短语“不能使用标准培养条件进行培养”是指在标准培养条件下(例如，细菌的标准培养条件包括:例如，在37°C下、在连续振摇的情况下，在溶菌肉汤(LB培养基)中生长至少14h)并不生长或扩增的微生物。例如，微生物可具有高于或低于标准培养条件下所使用的温度的最佳生长温度、或微生物需要在标准培养基中并不存在的必需营养素，因此不能通过使微生物在标准条件下生长或增殖来提高检测效果。类似地，在病毒微生物的情况下，“不能使用标准培养条件进行培养”可以是指例如，缺乏病毒在其中进行增殖的宿主细胞。本领域技术人员知晓微生物(如细菌和病毒)的标准生长技术和条件，并可容易地将这一知识应用于本文所述的测定法和方法中。
[0064]本文所使用的术语“已知的微生物序列”是指例如，微生物基因序列的数据库，如GenBank，并且可使用搜索工具(如BLAST)来对样品序列进行识别，从而在数据库中查询核酸序列同源性。在一些实施方式中，将已知序列与宏基因组文库数据库中的序列进行比较。术语“对照样品”包括无可检测的疾病的个体或多个个体的核酸，所述核酸已经使用本文所述的测定法和方法进行制备和测序。
[0065]本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
[0066]本文所使用的术语“基本由…组成(consisting essentially of)”对于给定实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外元素。
[0067]术语“由…组成(consisting of )”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
[0068]除非上下文中明确地另有所指，在本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。因此，例如，“方法(method)”的所指物包括一种或多种方法、和/或本文所述的类型的步骤、和/或对于本领域技术人员而言在阅读本发明后变得显而易见的内容等。
[0069]除非另有说明，本 文所述方法的实施将采用属于本领域之内的分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术。此类技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis, 1989年，分子克隆:实验室手册，第二版；寡核苷酸合成(M.J.Gait主编，1984年)；多核苷酸杂交(B.D.Harnes&S.J.Higgins主编，1984年)；分子克隆实用指南(B.Perbal, 1984年);酶学方法系列丛书(Academic Press公司);精编分子生物学实验指南(Ausubel 等主编，1995 年)。
[0070]可以理解的是，以下的详细描述和实例仅是说明性的，不应被视为对本发明范围的限制。对所公开的实施方式所做的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，其可在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出。另外，出于描述和公开的目的，将说明书和实施例中提及的全部专利、专利申请以及出版物通过引用明确并入本文，例如，在这些出版物中描述的可以与本发明相联系使用的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于 申请人:可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
【专利附图】

【附图说明】
[0071]图1A-图1C为显示回肠灌洗样品中的细菌比例的一系列饼状图。图1A示出第一患者的回肠灌洗样品；图1B示出使用未包覆珠进行免疫沉淀的相同回肠灌洗样品(即，对照)；图1C示出通过使用抗人IgG包覆珠进行回肠灌洗样品的免疫沉淀而制备的IgG富集部分。在IgG富集部分和对照非包覆珠部分之间，观测到10个PCR循环的丰度差异(SP，IgG珠中的富集与对照珠中相比超出1000倍)。在由肠灌洗和灌入(input-lavage)进行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和对照珠中分离DNA ;使用附着有适当的衔接子(adaptor)和接头(linker)的扩增16S DNA的V2区域的引物来产生文库，随后在454测序仪上对其进行测序。图1A-图1C显示基于V2同源序列并使用公共数据库的分配至个体操作分类单元(operational taxonomic units, 0TU)的序列的相对丰度，所述数据库如万维网上的greengenes.lbl.gov (在相比于对照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。为允许定性比较，对照珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA扩增更多倍。在灌洗中的细菌群落在组成上与以对照珠沉淀的细菌群落非常相似，但与由IgG珠下拉(pull down)的细菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的术语，IgG富集部分中的细菌为免疫系统刺激性微生物。[0072]图2A-图2C为显示回肠灌洗样品中的细菌比例的一系列饼状图。图2A示出第二患者的回肠灌洗样品；图2B示出使用未包覆珠进行免疫沉淀的相同回肠灌洗样品(即，对照)；图2C示出通过使用抗人IgG包覆珠进行回肠灌洗样品的免疫沉淀而制备的IgG富集部分。在由肠灌洗和灌入进行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和对照珠中分离DNA ;使用附着有适当的衔接子和接头的扩增16S DNA的V2区域的引物来产生文库，随后在454测序仪上对其进行测序。图2A-图2C显示基于V2同源序列并使用公共数据库的分配至个体操作分类单元0TU的序列的相对丰度，所述数据库如万维网上的greengenes.lbl.gov (在相比于对照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。为允许定性比较，对照珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA扩增更多倍。在灌洗中的细菌群落在组成上与以对照珠沉淀的细菌群落非常相似，但与由IgG珠下拉的细菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的术语，IgG富集部分中的细菌为免疫系统刺激性微生物。[0073]图3为示出来自患有炎症性肠病的患者的小肠分泌物的IgG包覆的细菌可以以本文所述的方法的实施方式，使用16S rDNA进行特异性下拉和测序的图。由16S rDNA的特异性引物，通过基于SYBR绿的定量实时PCR对16S rDNA的丰度(表示附着于抗IgG珠和对照珠的细菌的丰度)进行定量。IgG富集部分中的细菌相对于对照(灌洗，未包覆珠)而言是特异性的，并以两个以上的数量级(logs)(或大于100倍)富集。免疫沉淀物可包含活体微生物，包括可培养的细菌。免疫沉淀物也可包含不可培养的微生物，这可需要下一代测序以及鸟枪法、宏基因组、下一代测序。[0074]图4A-图4C表明，本文所述的免疫沉淀方法的实施方式可用于在使用常规方法被认为是无菌的样品中检测微生物(如病毒)。如本文所述，使用抗IgG或对照对来自HCV感染患者(图4A和图4C中的个体患者)的血清进行免疫沉淀，并由抗hlgG免疫沉淀物和对照沉淀物分离RNA。对RNA进行逆转录，并使用特异性引物测试HCV cDNA是否存在。如图4C中所示(与图4A为相同样品)，在抗hlgG免疫沉淀中检测到HCV信号的184倍和117倍的富集，对照沉淀物中则几乎不存在信号。这些附图表明，本文所述的免疫沉淀程序还可应用于“无菌”环境(如外周血);并且表明了，如本文所述，使用特异性检测这一 HCV阳性供体内的HCV RNA的引物，能够沉淀完全的病毒。可随后通过任何基于测序的手段检测扩增产物，例如，在病毒的情况下使用宏基因组手段、或对于细菌的情况使用宏基因组手段或基于16S的手段等。[0075]图5为示出用于本文所述的测定法和方法的示例性系统的方框图。[0076]图6为示出用于本文所述的系统的编码于计算机可读存储介质上的示例性指令的方框图。
【具体实施方式】
[0077]本文提供了用于在患者样品中检测和/或识别免疫刺激性微生物的“MilP-Seq”(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)测定法和方法。本文还提供了对感染性疾病进行诊断或对患者样品中的先前未特征化的微生物进行识别的方法。本文所述的测定法和方法与现有方法相比具有如下优势:(i)不需要用于微生物扩增的培养步骤；(ii)并非特异性针对特定微生物，可以用来识别先前未特征化的微生物；以及(iii)由于缺少微生物培养步骤，因此允许快速处理。
[0078]哺乳动物宿主(人类和非人类)中生长着(colonized)各种各样的共生微生物或致病微生物。免疫系统是否对微生物产生响应表示着微生物对于宿主是共生的还是致病的。目前的微生物学方法并未必然地将对生物体的免疫响应作为直接识别生物体的手段而纳入考量。微生物的存在通常由培养或类似类型的生物测定法确定。然而，仅仅存在微生物并未指明或确定微生物是否对宿主造成危害。例如，一些个体中的共生微生物在其它个体中可以为致病的。
[0079]相反，本文所述的测定法和方法利用免疫响应过程中产生的免疫蛋白对微生物进行直接检测，从而识别和区分介导特定疾病和失调的微生物，特别是对于不能对生物体进行培养的疾病和失调而言。此外，本文所述的方法适合于范围广泛的生物样品(如体液)的直接分析。
[0080]更具体而言，本文所述的测定法和方法针对微生物的检测，所述微生物刺激免疫系统并诱发免疫系统的一个或多个细胞或组件产生免疫蛋白。通过明确靶向以免疫复合物的形式存在的免疫蛋白所结合的微生物，本文所述的测定法和方法允许仅对来自宿主的生物样品中的诱发免疫响应的微生物进行检测和/或识别，而并不对存在但不引起对宿主的危害的微生物(例如，共生微生物)进行检测和/或识别。因此，通过关注结合至微生物的免疫蛋白，而非仅仅对微生物进行检测，本文所述的测定法和方法提供有针对性的和无偏倚的手段来对所述诱发免疫响应的微生物进行识别和富集。
[0081]免疫蛋白和免疫复合物
[0082]本文所述的测定法和方法针对微生物的检测，所述微生物刺激免疫系统并诱发免疫系统的一个或多个细胞或组件产生免疫蛋白。因此，在一些实施方式中，本文所述的测定法和方法涉及对一种或多种免疫蛋白或免疫复合物进行检测。
[0083]本文所使用的短语“免疫系统刺激性微生物”或“刺激免疫系统的微生物”是指既被受试者或宿主的先天性或获得性免疫系统识别、又在受试者中诱发免疫介导的响应的微生物(如细菌、真菌或病毒)。免疫系统刺激性微生物可以来自分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。通常情况下，如在本文中定义的术语，免疫系统刺激性微生物是“致病的”的，然而在一些情况下，典型的非致病性微生物(例如，共生细菌)仍然可以在受试者群体的子集(例如，患有炎症性肠病的受试者)中产生免疫介导的响应。因此，术语“免疫系统刺激性微生物”在本文中不与“致病的”互换使用。
[0084]基本上来说，任何响应外来微生物而活化或分泌的蛋白、或参与免疫介导的除去或结合微生物的蛋白可用 于与本文所述的测定法和方法结合来制备免疫蛋白富集部分。在免疫响应期间，分泌或产生一些可以结合至微生物或固定微生物的蛋白。结合至微生物时，无论是特异性(例如，抗体)还是非特异性(例如，补体级联(complement cascade)的组分)地，此类免疫蛋白形成“免疫复合物”，其被用于本文所述的测定法和方法中以促进对引起免疫响应的微生物进行检测和/或识别。
[0085]本文所使用的“免疫复合物”是指免疫蛋白(如抗体或补体分子)与可溶性抗原(如微生物)相结合的整体。此类包含结合的微生物的免疫复合物可使用本文所述的测定法和方法来进行识别和/或沉淀。在本文所述的方面的一些实施方式中，免疫蛋白为适应性免疫系统的蛋白(例如，免疫球蛋白)。在本文所述的方法的其它实施方式中，免疫蛋白为先天性免疫系统的免疫蛋白(例如，补体组分)。
[0086]补体系统
[0087]在本文所述的方面的一些实施方式中，补体可以为使用本文所述的测定法和方法来检测或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的组分。补体系统是指辅助抗体(例如，免疫球蛋白)和免疫系统细胞来从生物体中清除病原体的生化级联系统。这是在传统上称为先天性免疫系统的免疫系统的一部分，不具有适应性(即，在个体的一生中不发生变化)。然而，它可以对适应性免疫系统组分进行招募和活化，并且可以通过适应性免疫系统组分进行招募和活化。
[0088]补体系统包括血液中的小型蛋白，所述蛋白由数种触发物(trigger)之一刺激，并诱导系统中的蛋白酶切割特定蛋白以释放细胞因子，并起始进一步分裂的放大级联反应。这一活化级联反应的最终结果为细胞杀伤性膜攻击复合物(membrane attack complex)的响应和激活得以放大。超过25种蛋白和蛋白片段组成了补体系统，包括血清蛋白、浆膜蛋白(serosal protein)和细胞膜受体。补体系统通常被分为经典补体途径、替代补体途径、以及甘露糖结合凝集 素途径。任何可以结合或移除微生物(如细菌、真菌或病毒)的补体系统的蛋白均可用于使用本文所述的测定法和方法制备供使用的免疫蛋白富集部分。
[0089]经典补体途径的组分包括C1-复合物(由1分子的Clq、2分子的Clr和2分子的Cls组成，从而形成Clqr2s2),其在Clq结合至与抗原复合的IgG或IgM时形成、或在Clq直接结合至病原体表面时形成；C4及其片段(C4a和C4b) ;C2及其片段(C2a和C2b);经典途径C3转化酶，包含C4b和C2a ；C3及其片段(C3a和C3b);C5转化酶(包含C4b、C2a和C3b);C5及其片段(C5a和C5b) ；C6 ；C7 ；C8 ；C9 ;以及膜攻击复合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。C3b也可以结合至病原体表面。因此，在本文所述的测定法和方法的一些实施方式中，免疫蛋白为C1-复合物，Clq, C3b,或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻击复合物。
[0090]替代补体途径的组分包括C3及其片段(C3a和C3b)，所述片段由C3自发水解直接触发而形成，原因为通过缩合反应导致的硫酯键断裂；B因子；C3bB复合物，由B因子与结合至细胞膜的C3b相结合而形成；D因子；片段Ba和Bb，由B因子通过D因子切割形成；C3bBb或替代途径C3转化酶；C3bBb3b，其将C5裂解为C5a和C5b ；C5及其片段(C5a和C5b )；C6 ；C7 ；C8 ;C9 ;以及膜攻击复合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。IgA与替代途径的活化相联系。在本文所述的测定法和方法的一些实施方式中，免疫蛋白为C3b，C3bB复合物，或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻击复合物。
[0091]甘露糖结合凝集素途径包括甘露糖结合凝集素(MBL)，这是与MASP-1(甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶)和MASP-1I (两种蛋白酶酶原)形成复合物的具有2-6个头部的分子。MBL包含识别碳水化合物的头部，其结合至特定排列于病原体磷脂双分子层上的甘露糖残基，如微生物的碳水化合物或糖蛋白组分上的甘露糖残基，所述微生物包括细菌，如沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)和奈瑟氏球菌(Neisseria)菌株；真菌病原体，如白色念珠菌(Candida albicans)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；以及病毒，如HIV-1和呼吸道合胞病毒(RSV)。由MBL对病原体上的碳水化合物进行识别使得MASP-1和MASP-1I活化，从而将补体组分C4和C2切割为C4a、C4b、C2a和C2b。在本文所述的测定法和方法的一些实施方式中，免疫蛋白为甘露糖结合凝集素(MBL)。
[0092]免疮球蛋白
[0093]在本文所述的方面的一些实施方式中，免疫球蛋白可以是使用本文所述的测定法和方法来检测或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的组分。从本质上讲，任何本领域技术人员已知的免疫球蛋白均可用于制备免疫球蛋白富集部分(即，免疫蛋白富集部分)。 [0094]免疫球蛋白为具有抗体分子特征性的免疫球蛋白折叠的多肽家族，通常包含两个β折叠和保守的二硫键。免疫球蛋白超家族的成员参与细胞性和非细胞性的体内相互作用的许多方面，包括在免疫系统中的广泛角色(例如，抗体、Τ细胞受体分子等)、参与细胞粘附(例如ICAM分子)、以及细胞内的信号转导(例如，受体分子，如TOGF受体)。
[0095]在一些实施方式中，用作本文所述的测定法和方法中的免疫蛋白的免疫球蛋白为抗体分子。在一些此类实施方式中，所述免疫球蛋白为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些此类实施方式中，免疫球蛋白为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些此类实施方式中，免疫球蛋白为IgAl或IgA2。
[0096]所有的抗体免疫球蛋白的基本结构基于由两条轻多肽链和两条重多肽链组成的单元。每条轻链包含称为轻链可变区和轻链恒定区的两个区域。同样，免疫球蛋白重链包含称为重链可变区和重链恒定区的两个区域。
[0097]重链或轻链的恒定区由称为重链或轻链恒定区基因(CM)区段(segment)的基因组序列进行编码。特定重链基因区段的使用限定了免疫球蛋白的类型。例如，在人类中，μ恒定区基因区段限定了 IgM类抗体；而Yl、Y2、口或Y 4恒定区基因区段的使用则限定了 IgG类抗体，以及由IgGl至IgG4的IgG亚类。同样，α 1或α 2恒定区基因区段的使用限定了 IgA类抗体，以及IgAl和IgA2亚类。δ和ε恒定区基因区段则分别限定了 IgD和IgE类抗体。
[0098]免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区中一起含有抗体的抗原结合域。可变区要求抗体具有允许与范围广泛的抗原相结合的多样性。结合至循环的抗原的抗体可形成免疫复合物，这可使用本文所述的测定法和方法进行富集。
[0099]其它免疫蛋白
[0100]也可考虑将其它在响应微生物(如细菌、病毒或真菌)时诱发并可与微生物结合、并可用于形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白用于本文所述的方法和测定法中。此类免疫蛋白应当能够与微生物相结合，从而形成如本文所述的术语的免疫复合物，其可包括但不仅限于:c-反应蛋白(CRP)，存在于血液中，并且可与在死亡或濒临死亡的细胞和某些类型的细菌表面上表达的磷酸胆碱相结合；血清淀粉样蛋白P (SAP);胶原凝集素(collectin),包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)、肝胶原凝集素1 (CL-L1)、胎盘胶原凝集素1 (CL-P1)、共凝集素(conglutinin)、43kDa的胶原凝集素(CL-43)和46kDa的胶原凝集素(CL-46 )，其包含C-型凝集素域(也称为碳水化合物识别域(CRD ))，并被用于选择性结合至微生物的特定碳水化合物复合物；肽聚糖(peptidoglycan)识别蛋白(PGR) ;LRR、XA21D ；防御素(例如，防御素α 1、中性粒细胞防御素1、防御素αΙΒ、防御素α 3、中性粒细胞防御素3、防御素α 4、防御素5、防御素6、0_防御素1、β _防御素2、β -防御素103、β-防御素107、β-防御素110、β-防御素136);脂多糖结合蛋白(LBP);N0D蛋白，其通过C-末端富含亮氨酸的区域与微生物相互作用(N0D1，其识别含有胞壁酰二肽NAG-NAM- y -D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸的肽聚糖，其为常见的革兰氏阴性菌以及少数革兰氏阳性菌中肽聚糖单体的部分；以及N0D-2，其识别含有胞壁酰二肽NAG-NAM-L-丙氨酰基-异谷氨酰胺的肽聚糖，其存在于几乎所有细菌中)；NALPS (NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13 和 NALP14)、IPAF、以及 NAIP5/Bircle。
[0101]在本文所述的方面的一些实施方式中，由响应微生物(如细菌、病毒或真菌)而诱发、可与微生物相结合从而形成免疫复合物、并可用于形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白属于称为“模式识别受体”或PRR的分子组。
[0102]模式识别受体或PRR是指可以特异性结合至微生物分子的保守部分(由相关微生物所共有，对于这些生物体的生存必不可少)的多种受体分子，且并未发现与非微生物细胞(如哺乳动物细胞)有关联。这些独特的微生物分子在本文中称为“病原体相关的分子模式(PAMP)”或“微生物相关的分子模式(MAMP)”。可以由PRR识别的微生物相关的分子模式的实例包括但不仅限于:革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的脂多糖(LPS);细菌的脂蛋白和脂肽；革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的孔蛋白(porin);革兰氏阳性细菌细胞壁中大量存在、革兰氏阴性细菌细胞壁中存在程度较低的肽聚糖；革兰氏阳性细菌细胞壁中发现的脂磷壁酸；抗酸(acid-fast)细胞壁 中发现的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan);富含甘露糖的聚糖(glycan)(甘露糖或果糖作为末端糖的短糖链)，在微生物的糖蛋白和糖脂中常见，但在人类的糖蛋白和糖脂中罕见；在细菌鞭毛中发现的鞭毛蛋白；细菌和病毒核酸，因为细菌和病毒的基因组中含有高频率的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸或CpG序列(缺少甲基或CH3基团并与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶)，而哺乳动物DNA的CpG序列频率较低且大部分被甲基化(可以掩蔽模式识别受体的识别)，并且人类的DNA和RNA通常不会进入细胞内体(endosome)(微生物的DNA和RNA的模式识别受体位于其中)；N_甲酰甲硫氨酸，细菌蛋白中的常见氨基酸；双链病毒RNA，为许多病毒在其复制的一些阶段所特有；来自具有RNA基因组的多种病毒的单链病毒RNA ;酵母细胞壁中的脂磷壁酸、糖脂和酵母多糖；以及磷酸胆碱和微生物膜中的其它常见脂质。
[0103]可以用作免疫蛋白或用于形成免疫蛋白富集部分而在本文所述的方法和测定法中使用的PRR的实例包括但不仅限于:甘露糖受体，其结合至富含甘露糖的聚糖(甘露糖或果糖作为末端糖的短糖链，在微生物的糖蛋白和糖脂中常见，但在人类的糖蛋白和糖脂中罕见)；清道夫受体(scavenger receptor),其可以结合至细菌细胞壁组分(如LPS、肽聚糖和磷壁酸)，并且包括例如⑶36、⑶68和SRB-1 ;调理素受体，如在血浆中循环的急性期蛋白(acute phase protein),如甘露糖结合凝集素和C_反应蛋白(CRP)(结合至细菌膜中的磷酸胆碱和真菌膜中的磷脂酰乙醇胺)、在肺部的肺泡内发现的表面活性蛋白，如SP-A和SP-D ；N-甲酰蛋氨酸受体，如FPR和FPRL1 ;CD14，其促进TLR-4响应LPS的能力；含CARD(半胱天冬酶活化和招募结构域)的蛋白，如RIG-1 (视黄酸诱导基因-1)和MDA-5 (黑色素瘤分化相关基因-5)，其为细胞质的传感器，识别在病毒感染的细胞中产生的病毒双链和单链RNA分子，并触发称为干扰素的细胞因子(阻断在感染的宿主细胞内的病毒复制)的合成；以及Toll样受体或TLR家族的成员，其直接或间接地与不同微生物分子相结合。
[0104]TLR家族的不同成员对于不同的MAMP具有结合特异性，如TLR-2识别肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸(LTA)和孔蛋白；TLR-4识别革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖(LPS)、真菌甘露聚糖、病毒包膜蛋白、寄生磷脂和热休克蛋白；TLR-5识别细菌鞭毛；TLR-l/TLR-2对与寄生虫中的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白和细菌脂肽特异性结合；TLR-2/TLR-6对与革兰氏阳性细菌细胞壁的脂磷壁酸(LTA)、细菌脂肽和肽聚糖结合；TLR-3，与双链病毒RNA结合；TLR-7，与单链病毒RNA (如艾滋病中)(富含鸟嘌呤/尿嘧啶核苷酸对)结合；TLR-8，与单链病毒RNA结合；TLR-9，与在细菌和病毒基因组中发现的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG DNA)结合。
[0105]患者和患者样品
[0106]若生物样品包含免疫蛋白，如补体蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原体识别受体(PRR)，则来自患者的生物样品可以使用本文所述的测定法和方法从待分析个体的任何器官或组织中获得。在一些实施方式中，此类样品可以进一步处理，以对样品中期望的免疫蛋白进行富集，从而产生如本文所使用的术语“免疫蛋白富集样品”。在其它实施方式中，可在制备免疫蛋白富集部分之前对生物样品进行进一步分离或纯化。例如，可以通过例如以抗凝血剂(如肝素)处理全血样品、离心样品直至细胞沉淀以允许从上层水层中去除血浆，从而从全血样品中分离血浆和血清。可以从生物样品或根据如上文所述或本领域技术人员已知的方式处理过的样品中检测蛋白和核酸。
[0107]用于本文所述的 方法和测定法的生物样品的一些非限制性实例包括血液样品、尿样品、精液样品、淋巴液样品、脑脊液样品、血浆样品、血清样品、脓液(pus )样品、羊水样品、体液样品、粪便样品、肠灌洗样品、活检样品、拭子(swab )样品、口腔漱洗样品、组织样品、皮肤分泌物样品，或此类样品的组合。对于本文所述的方法，生物样品优选来自全血、血浆、肠灌洗样品、脑脊液、关节液、血清、和/或呼吸道样品，如呼吸道分泌物(如痰)或呼吸道灌洗液(如支气管肺泡灌洗液)。术语“生物样品”包括由初始样品衍生的样品，例如，在进一步处理后用于本文所述的测定法和方法的生物样品。此类衍生样品例如可包括由样品提取的核酸或蛋白；或经由将所述样品进行如核酸扩增或mRNA逆转录，或对特定核酸、蛋白、其它细胞质组分或核组分进行分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白。
[0108]术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，是指动物，特别是人，对于所述受试者，期望对由其获得的生物样品中免疫系统刺激性微生物的存在进行分析。在一些实施方式中，受试者需要对疾病或失调进行诊断，例如对炎症性肠病、感染性疾病或自身免疫性失调进行诊断，其中，使用本文所述的方法和测定法对生物样品进行分析。
[0109]制备免疫蛋白g集部分
[0110]用于本文所述的方法的免疫蛋白富集部分通常通过免疫沉淀来制备，免疫沉淀是指使用特异性结合至特定蛋白抗原的抗体，将蛋白抗原或蛋白复合物(例如，与微生物结合的免疫蛋白(如IgG)、PRR、或补体)由溶液中沉淀出来的技术。对免疫蛋白进行免疫沉淀的方法在本领域是公知的和/或在例如美国专利N0.4，618，589中有所描述(以引用的方式将其整体并入本文)。本文中提供了关于免疫沉淀方法的注意事项的一般概述，并且，如本文所证实的，本领域技术人员可以容易地改进这些注意事项来为用于检测结合的微生物的期望的免疫蛋白进行免疫沉淀方案的优化。
[0111]免疫沉淀是一种基于亲和性的分子“下拉”方法，该方法允许本领域技术人员使用任何亲和结合剂(所述亲和结合剂例如直接缀合至聚合物载体，对一个或多个特定生物分子靶标具有特异性亲和性)对复合物进行纯化。免疫沉淀的基本过程包括三个阶段。第一阶段涉及制备抗原溶液或裂解物。第二阶段涉及预清除抗原溶液或裂解物的非特异性背景结合；第三阶段涉及免疫复合物的形成和纯化。纯化后，可以采用许多方法中的任一种来对通过免疫沉淀过程“下拉”的抗原和材料进行分析。可用于基于亲和性的分子下拉与免疫沉淀技术的多种程序在Harlow，E.和Lane，D.(编辑)，“抗体:实验室手册”，第7章，ColdSpring Harbor Press，纽约(1988)中有详细描述，以引用的方式将其内容整体并入本文。
[0112]在本文所述的方法的各个方面和实施方式中，免疫沉淀可使用由患者获得的待用作用于进行免疫沉淀的溶液的任何生物样品进行。在本文中还涵盖了如下情况:在一些实施方式中，通过将包含细胞或组织的患者样品与温和的清洁剂接触而由该样品制备裂解物。温和的清洁剂在除去膜、干扰多种弱分子间相互作用及从细胞中释放大多数抗原这些方面有效，并且不破坏感兴趣的抗原(如结合至微生物的免疫蛋白)的构象或生化活性。通过以不与感兴趣的抗原(例如本文所述的免疫蛋白)结合的抗体对抗原溶液进行预处理而使非特异性结合的蛋白的干扰最小化，以除去非特异性结合的蛋白。
[0113]用于使用本文所述的方法对微生物进行分析和测定的完整蛋白复合物(如患者样品中存在的免疫复合物)的免疫沉淀通过选择亲和结合剂(如抗体或其片段)起作用，其靶向已知的蛋白(例如免疫蛋白，如补体蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原体识别受体(PRR))，该已知蛋白被认为是复合物的组件(member )。通过使用抗体或其片段祀向这一已知组件，使得如下成 为可能:将整个蛋白复合物从溶液中拉出，从而识别和/或检测该免疫复合物中的未知组分(如结合至免疫蛋白的微生物)。在本文所述的方法中使用的免疫复合物的免疫沉淀可以通过向裂解物或患者样品中加入亲和结合剂(如，在一些实施方式中为抗体或其片段，所述抗体或其片段对所富集的免疫蛋白具有特异性)而实现。抗体对于其各自的抗原具有高亲和力，因此迅速形成抗体-抗原复合物。在本文所述的方法的一些实施方式中，用于对免疫复合物进行免疫沉淀的亲和结合剂例如可包括对于一类或一组目标免疫蛋白(例如，全部人类IgG分子，无论任何亚类)具有特异性的蛋白或分子；或对于具有共同的结构域的一组免疫蛋白具有特异性的蛋白或分子。
[0114]因此，本文所述的免疫沉淀步骤可用于产生在本文所述的测定法和方法中所使用的免疫蛋白富集部分。“免疫蛋白富集部分”是指部分纯化(例如，通过免疫沉淀)的样品，所述部分纯化使得期望的或目标免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、补体、PRR、或先天性或适应性免疫相应的其它可溶性/循环组分)在样品中的水平与衍生所述样品的初始患者样品相比提高至少10%。在一些实施方式中，与衍生所述样品的患者样品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。由此产生的免疫蛋白富集部分随后用于本文所述的测定法和方法中，从而对任何结合至目标免疫蛋白的微生物进行识别。[0115]任何对于目标免疫蛋白具有亲和性和特异性的亲和结合剂均可以用于本文所述的免疫沉淀方法。“亲和结合剂”为对于目标免疫蛋白、免疫蛋白类、或免疫蛋白家族具有高亲和性和特异性的试剂(如蛋白(例如抗体或其片段))，其可用于制备在本文所述的测定法和方法中使用的免疫蛋白富集部分。对用于制备免疫蛋白富集部分的亲和结合剂的选择涉及本领域普通技术人员已知的注意事项，如具有期望特异性和亲和性的亲和结合剂的可利用性、由所述亲和结合剂靶向的不同免疫蛋白的数量和/或类型、具有同等特异性和/或亲和性的不同亲和结合剂的相对成本等。
[0116]相应地，在本文所述的方法的一些实施方式中，使用抗体或其片段作为亲和结合剂制备免疫蛋白富集部分。适于制备免疫蛋白富集部分并进行如本文所述的MilP-Seq方法和测定法的免疫沉淀步骤的抗体优选为单克隆特异性抗体，可包括但不仅限于:小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、人或嵌合抗体(chimeric antibody),并且可以包括单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、和/或任何上述抗体的抗原结合片段。如本领域技术人员所知的，用于本文所述的方法的抗体及其抗原结合片段的优点包括针对任何期望的免疫蛋白、免疫蛋白类、或免疫蛋白家族而产生所述抗体及其抗原结合片段的能力。
[0117]术语“单克隆抗体”是指由大体上均质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的自然发生的突变以外，抗体群中所包含的各个抗体均是相同的。单克隆抗体针对单一抗原(如免疫蛋白)具有高度特异性。此外，与通常包括针对抗原的不同决定簇(表位)(例如，免疫蛋白(如IgG分子或PRR)上的多个位点)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每一单克隆抗体均针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求由任何特定方法进行抗体生产。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可以通过Kohler等，Nature256:495 (1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA法(参见，例如，美国专利N0.4，816，567)制备。“单克隆抗体”也可以通过使用例如Clackson等，Nature352:624-628 (1991)或 Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)中所描述的技术由噬菌体抗体文库中分离。存在许多用于获取对在本文所述的免疫沉淀步骤中使用的免疫蛋白具有特异性的单克隆抗体或其片段的商业来源，所述商业来源包括但不仅限于:BDBiosciences、eBioscienc es、RnD Systems、Invitrogen、BioLegend、Abeam 等。
[0118]在一些实施方式中，用于本文所述的方法的免疫沉淀步骤的抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。此类抗体例如在期望具有针对免疫蛋白富集部分中的两种以上免疫蛋白的特异性的情况下是有用的。在一些此类实施方式中，可以使用具有IgG样结构的双特异性抗体，其中，一个抗原结合区(由VH和VL结构域组成)特异性结合至一种免疫蛋白；另一个抗原结合区(也由VH和VL结构域组成)特异性结合至另一种免疫蛋白。在一些实施方式中，每一可变区(2个VH区和2个VL区)被替换为dAb或单个可变结构域。包含于IgG样结构中的dAb或单个可变结构域可具有相同特异性或不同特异性。在一些实施方式中，IgG样结构是四价的，并可具有两种、三种或四种特异性。IgG样结构的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv、scFv)可通过本领域技术人员已知的方法制备。在其它实施方式中，双特异性抗体包括交联抗体或“杂缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，杂缀合物中的抗体之一可结合至亲和素(avidin)、另一抗体则结合至生物素。此类抗体例如已被提出用于使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4676980);以及用于治疗HIV感染(W0 91/00360.W0 92/200373、以及EP 03089)。杂缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制得。合适的交联剂在本领域中是公知的，并在美国专利N0.4，676，980中和许多交联技术一同公开。
[0119]在一些实施方式中，用于在本文所述的方法的免疫沉淀步骤中使用的抗体可包括“抗体片段(antibody fragment)” 或“其抗体片段(antibody fragment thereof)”。本文所使用的术语“抗体片段”或“其抗体片段”是指仅包含完整抗体的一部分的蛋白片段，通常包含完整抗体的抗原结合位点，并因此保留结合抗原(如免疫蛋白)的能力。所涵盖的用于本文所述的方法的抗体片段的实例包括:(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab/片段，为在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域并在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(v)具有抗体单臂上的VL和VH结构域的Fv片段；(vi )由 VH 结构域组成的 dAb 片段(Ward 等，Nature341, 544-546 (1989))； (vii )分离的 CDR区；(viii)F(ab' ) 2片段，为包含两个Fab'片段(这两个片段在铰链区由二硫桥连接)的二价片段;(ix)单链抗体分子(例如单链 Fv ；scFv) (Bird 等,Science242:423-426 (1988)和Huston等，PNAS (USA)85:5879-5883 (1988)); (x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含在同一多肽链上连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)(参见，例如，EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;以及 Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448(1993)) ;(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.8 (10):1057-1062 (1995)和美国专利N0.5，641，870)。 [0120]在本文所述的方法的一些实施方式中，免疫富集部分使用不是抗体或抗原结合片段的蛋白分子作为亲和结合剂而制备，所述蛋白分子例如为蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L
坐寸。
[0121]蛋白A是40_60kDa的MSCRAMM表面蛋白，最初发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中。蛋白A包含5个同源Ig结合域，折叠成一个三螺旋束，其中每一个都能够结合来自许多不同的哺乳动物的蛋白，尤其是IgG。蛋白A在多数免疫球蛋白的Fc区域内与重链结合，并且在人VH3抗体家族的情况下还在Fab区域内与重链结合。蛋白A以高亲和性与人IgGl、IgG2和IgG4以及小鼠IgG2a和IgG2b结合。蛋白A以中等亲和性至高亲和性与人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl结合。蛋白A与人IgG3或I⑶不起反应，也不与小鼠IgM、IgA或IgE起反应。因此，在本文所述的方法的一些实施方式中，当本文所述的方法中的目标免疫蛋白为人IgGl、人IgG2、人IgG3或它们的任意组合时，使用蛋白A作为亲和结合剂。在本文所述的方法的一些实施方式中，当本文所述的方法中的目标免疫蛋白为人IgA、人IgM、人IgE或它们的任意组合时，使用蛋白A作为亲和结合剂。在本文所述的方法的一些实施方式中，当本文所述的方法中的目标免疫蛋白为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgA、人IgM、人IgE或它们的任意组合时，使用蛋白A作为亲和结合剂。
[0122]蛋白G为在C族和G族链球菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白，与蛋白A很相似，但具有不同的特异性。蛋白G为65-kDa (G148蛋白G)和58kDa (C40蛋白G)的细胞表面蛋白。天然分子还结合白蛋白，然而，由于血清白蛋白是抗体源的主要污染物，因此白蛋白结合位点已从重组型蛋白G中移除。蛋白G以高亲和性与所有人类IgG亚类结合，即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4，但不与人IgG、IgM、IgA、IgD和IgE结合。因此，在本文所述的方法的一些实施方式中，当本文所述的方法中的目标免疫蛋白为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4或它们的任意组合时，使用蛋白G作为亲和结合剂。
[0123]蛋白Α/G是联合了蛋白A和蛋白G两者的IgG结合域的重组融合蛋白。蛋白A/G包含4个来自蛋白A的Fc结合域和2个来自蛋白G的Fc结合域。与蛋白A相比，蛋白A/G的结合比较不依赖于pH值，但除此以外具有蛋白A和蛋白G的额外特性。蛋白Α/G与人IgG的所有亚类(即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4)以及IgA、IgE、IgM和IgD (与IgD的程度较低)结合。相应地，在本文所述的方法的一些实施方式中，当本文所述方法中的目标免疫蛋白为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD或它们的任意组合时，使用蛋白A/G作为亲和结合剂。
[0124]蛋白L最早由大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)细菌的表面分离，并发现其通过L链相互作用与免疫球蛋白结合。蛋白L不包含任何链间二硫环，也并非由二硫键连接的亚基组成。与结合至免疫球蛋白Fc区域的蛋白A和蛋白G不同，蛋白L通过轻链kappa相互作用与抗体结合。由于在结合相互作用中不涉及重链的任何部分，因此蛋白L结合的抗体类比蛋白A或蛋白G范围更广。蛋白L与典型的全部抗体类结合，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。单链可变片段(scFv)和Fab片段也与蛋白L结合。蛋白L结合限于包含kappa轻链的抗体,并且在此类抗体中仅与kappa轻链的特定亚型结合。例如，蛋白L与人Vk 1.Vk III和Vk IV亚型结合，但不与Vk II亚型结合。因此，在本文所述的方法的一些实施方式中，当目标免疫蛋白为包含人Vk 1.Vk III和Vk IV亚型轻链的任何人Ig分子(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD)时，使用蛋白L作为亲和结合剂。
[0125]在本文所述的方法的一些实施方式中，对目标免疫蛋白具有特异性的亲和结合剂(例如，蛋白G、蛋白A、对特定蛋白或蛋白类/家族/族具有特异性的抗体或其片段)被固定于固相基底(例如超顺磁微珠或微尺度琼脂糖珠或琼脂糖树脂珠(非磁性))上。随后可通过以下方法对免疫蛋白复合物进行纯化:将亲和性珠悬浮液(如蛋白A或蛋白G珠悬浮液)或预包覆有对免疫蛋白具有特异性的抗体或其片段的珠(如抗-1gG、抗-1gA、或抗补体组分的预包覆珠，例如MACS顺磁珠(Miltenyi Biotec.))加入含有抗体-抗原复合物的溶液中。例如，当免疫蛋白富集部分包含IgG或IgA作为欲沉淀的免疫蛋白、并且使用蛋白A或蛋白G作为亲和结合剂时，由于蛋白A和蛋白G对于抗体的Fc部分具有高亲和性，因此发生纯化。
[0126]在其它实施方式中，将亲和结合剂(如蛋白G、蛋白A、对特定蛋白或蛋白类/家族/族具有特异性的抗体或其片段)直接加入包含待富集的免疫蛋白(如免疫球蛋白、PRR、补体蛋白)的样品中。在此类实施方式中，亲和结合剂未附着至固相载体，因此，例如，亲和结合剂自由浮动于包含待富集的免疫蛋白的样品周围，并与它们的目标结合。随后，将包覆有第二亲和结合剂(如对第一亲和结合剂具有特异性的蛋白Α/G)的珠添加至亲和结合剂(例如抗体或其片段)与免疫蛋白复合物的混合物。目前与其免疫蛋白目标相结合的亲合结合剂(例如抗体或其片段)随后可由第二亲和结合剂与珠结合。
[0127]在目标免疫复合物通过例如免疫蛋白Α/G-抗体相互作用而结合至珠之后，通过离心收集珠，并通过洗涤珠除去未结合的蛋白。可以通过如下方式对珠进行清洗:使用如裂解缓冲液的溶液冲洗珠并通过抽吸除去裂解物和洗涤缓冲液。完全除去洗涤缓冲液对于降低背景和提高免疫测定法的有效性是很重要的。
[0128]适合用于实施本文所述的MilP-Seq方法的免疫沉淀步骤的珠或其它固相载体平台可以是本领域技术人员已知的任何形式或材料。可以使用高多孔性琼脂糖珠(也被称为琼脂糖树脂或衆料(slurry)),由于琼脂糖颗粒(大小50至150微米)的几乎全部海绵状结构均可用于亲和性结合剂(如抗体或其片段)的附着，该珠具有非常高的潜在结合能力。
[0129]超顺磁珠也可以用于本文所述的Milp-Seq测定法和方法的一些实施方式中。此类磁珠为固体，，取决于不同的珠类型，通常是球形的，并且，亲和结合剂(如抗体或其片段、蛋白A、蛋白G等)的结合被限制于各珠的表面。磁珠明显小于琼脂糖珠(1至4μπι)，并且，虽然这些珠不具备增加结合能力的多孔中心这一优点，较高的每体积的磁珠数总体使得磁珠具有用于最佳结合的有效表面面积与体积的比值。可商购的磁珠可根据大小的均一程度分为单分散珠和多分散珠。单分散珠也称为微珠，表现出精确的均一'I"生，因此，全部珠具有相同的物理特性(包括结合能力和对磁铁的吸引水平)。多分散珠尽管与单分散珠大小相似，但显示出宽范围的大小可变性(1至4μπΟ，其可以影响所述多分散珠的结合能力和磁场捕获。虽然可用于本文所述的测定法和方法的免疫沉淀步骤的这两种类型的珠均是可商购的，然而质量更高的单分散超顺磁珠凭借其一致的尺寸、形状和性能而更加适合用于自动化方案。单分散性超顺磁珠和多分散性超顺磁珠由许多公司提供，包括但不仅限于Invitrogen、Thermo Scientific 以及 Millipore。
[0130]在免疫复合物的形成和纯化完成后，可立即对产生的免疫沉淀的蛋白或免疫蛋白复合物进行进一步分析，或将其存储以用于后续分析。通常，在传统免疫沉淀方法中，下一步骤为通过SDS-PAGE分离蛋白。然而，在本文所述的MilP-Seq方法中，接下来通过如下方式对免疫沉淀的免疫复合物在核酸水平上进行分析:裂解免疫沉淀的免疫复合物的微生物组分或细胞，从裂解的微生物 组分中提取核酸，并对提取的核酸进行测序。
[0131]对微生物核酸进行提取
[0132]从样品(如来自如本文所述的免疫沉淀的免疫复合物的微生物组分的裂解提取物)中提取核酸的方法是本领域中的常规方法，其包括例如如下方法:苯酚-氯仿沉淀、基于离心柱(spin column)的核酸纯化、乙醇沉淀和柱纯化。这些方法是本领域中公知的，并且，用于核酸纯化的试剂盒可容易地由商业来源(如QIAGEN?、Mo-Biol?以及
SIGMA-ALDRICH*)获得。
[0133]对提取的核酸进行测序
[0134]由免疫蛋白富集部分中提取的核酸可通过本领域中已知的任何方法(包括例如，鸟枪法克隆和下一代测序法)进行测序。
[0135]在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，对提取的核酸的测序通过Sanger测序方法或其变体进行。这一过程涉及制备样品(通常为PCR产物的扩增产物或扩增子)。在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，从免疫蛋白富集部分中提取的核酸在测序前不进行扩增。随后对所提取的核酸样品或其扩增子进行测序反应(即，ABI’ s BigDye终止子循环反应(terminator cycle reaction)),在该反应中，DNA聚合酶掺入2' ,3' -二脱氧-dNTP终止子，产生早期链终止DNA片段。采用电泳分析对反应混合物进行分析，测序结果示于色谱图中。在自动测序仪中，一轮ABI的96通道毛细管电泳(CE)分析产生总数为96X700、或67k碱基(kbp)的读段(read)。在CE测序中，对每个序列制备测序样品，并随后加载于96孔板中。有文献报道，微芯片上的CE允许更快和更简单的结果，但操作模式基本上类似于自动化CE测序仪。
[0136]在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，对提取的核酸使用的测序方法为焦磷酸测序(pyrosequencing)。焦磷酸测序在多种出版物和专利(包括例如，美国专利N0.6，210, 891,7, 264，929和7，335，762)中已有所描述。在焦磷酸测序中，通过使用沉积于PTP孔中的1百万或2百万珠进行乳液PCR来制备模板。硫酸化酶(sulphurylase)和荧光素酶(luciferase)附着的较小的珠围绕于模板珠周围，并且个体磷酸脱氧核苷酸(dNTP)被依次分配于各个孔中。当与模板互补的dNTP掺入增长链时，焦磷酸盐(ppi)被释放，并转化为ATP。ATP将荧光素氧化为氧化荧光素并释放出光。检测器检测释放的光并将该事件与掺入的dNTP建立联系。这一技术提供了约400个碱基的读段，并可检测约6个碱基的均聚物链。[0137]在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，使用连接反应(ligation)对提取的核酸进行测序。通过连接反应进行的测序已在多种出版物和专利中有所描述，包括美国专利N0.5,912, 148和6，130,073。在“通过连接反应进行的测序”中，约一百百万个乳液PCR模板珠沉积在载玻片上，并将通用引物退火至模板上。将含有两组探测碱基(interrogation base)(每组探测碱基具有与其相连的选定的染料)的探针加入模板，与目标序列互补的探针则与之退火。探针内的16种不同的二核苷酸以4种不同的染料进行编码。根据四色成像，连接的二核苷酸探针被化学裂解，产生磷酸基团。杂交、连接、成像和裂解的循环总共重复七次，从而可识别正确的两个碱基序列。然后，从模板中移除通用引物，并使用η-l引物进行第二轮连接,所述连接使得探测碱基之一连结至51末端(sets theinterrogation base one base to the51 end)。再进行七轮杂交、连接、成像和裂解，并再进行3轮的移除和连接，产生以色彩空间编码的35数据位的字符串(string)。将这些字符串与参比基因组进行比对，从而解码该DNA序列。
[0138]存在两种采用可逆终止子来完成供本文所述的方法和测定法使用的DNA测序的技术。在第一种技术中，DNA片段的桥式扩增随机分布在载玻片的8个通道上，高密度的正向和反向引物与这些片段共价连接。固相扩增由个体单链模板产生约8000万个分子簇。引物退火至模板中各分子簇的游离末端。聚合酶延伸并随后由四种可逆终止子组终止DNA合成，各终止子标记有不同染料。未掺入的可逆终止子被洗涤去除，并使用四色成像完成碱基识别。通过化学裂解除去阻断和染料基团，以使得可以进行另一循环。在使用可逆终止子的第二种技术中，数百万的未扩增的ssDNA模板被制备为带有聚(dA)尾，该聚(dA)尾与共价结合至载玻片上的聚(dT)引物杂交。对于一通测序(one pass sequencing),这一引物-模板复合物是足够的；但对于双通测序(two pass sequencing),模板链被拷贝，原始模板被移除并将引物朝向表面退火。与第一可逆终止子技术不同，可逆终止子均标记有相同的染料，并以预定的顺序各自进行分配。掺入事件引发荧光信号。美国专利N0.7，169，560描述了利用这种可逆引物技术的方法。
[0139]在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，将如下测序用于所提取的核酸:利用标记有荧光共振能量转移(FRET)的分子的DNA聚合酶，通过在cognate dNTP (其末端磷酸基团处标记有FRET分子)的掺入过程中产生的FRET信号进行的测序。标记的dNTP在与模板链具有正确互补性时掺入，而由于两个FRET分子之间的相互作用的FRET标记了碱基延伸事件，由此产生序列读段。此方法的优点在于，实时记录DNA聚合，并合成不作任何修饰的常规DNA，从而可记录更长的DNA读段(参见，例如，美国专利N0.7，329，492、美国专利 N0.7，361，466 ；Eid, J.等，(2009 年):323 (5910):133_8)。
[0140]为了提高速度和降低成本的这些目标，已经在包括通过杂交、通过合成(3’ -延伸)、通过连接、通过聚合酶克隆(polony)聚合、通过纳米孔、通过染料标记的dNTP的聚合酶掺入、以及通过其它一些方法对DNA进行测序的方面有所进展。DNA测序技术的快速进步(例如454’ s高通量焦磷酸测序(454 Life Science) (Margulies等，(2005)Nature437, 376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452，872-826 ；Ronaghi 等，(1996) AnalBiochem242,84-89 ；Ronaghi 等(1998) Science281，363-365);通过在表面上由单一克隆进行合成的 Illumina/Solexa 测序(Illumina) (Margulies 等，(2005) Nature437,376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452,872-826) ；ABI 公司的 SOLiD 技术(“SupportedOligonucleotide Ligation and Detection，，, Applied Biosystems) (Cloonan 等，(2008)Nat Methods5,613-619);基因组学分析；和生物信息学技术)已经大大开辟研究人员获得复杂生物系统的深入的分子图片的机会。各种类型的高通量DNA测序已被开发，并已被用于解析(delineate)核酸序列。此类方法应用于测序仪中，所述测序仪例如包括454GenomeSequencer FLX 仪器(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa) GenomeAnalyzer>Applied Biosystems 的 ABI SOLiD 系统、Helicos 单分子测序装置(HeliScope)、以及1n Torrent Systems Inc.的1n半导体测序。另见，例如，美国专利申请公开N0.20110111401和N0.20110098193。可以理解的是，随着测序技术的发展，对通过本文所述的方法提取的核酸所进行的分析可使用本领域技术人员认为适当的任何新测序方法进行。
[0141]鸟枪法克隆
[0142]在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，使用鸟枪法对提取的核酸进行测序。在鸟枪法测序中，DNA被随机破坏为许多小区段，并使用链终止法对所述小区段进行测序以获得“读段”。通过进行数轮这一片段化和测序过程来获得目标DNA的多个重叠读段。计算机程序随后使用不同读段的重叠末端以将其汇编为连续序列。
[0143]通常情况下，将长度往往超过100，000个碱基(1001*)的大分子DNA进行片段化和缩减(reduced),从而成为许多约l_4kb的亚克隆的文库，以用于扩增(propagation)和序列分析。多数大规模DNA测序策略依赖于多步过程，使目标分子随机片段化为这些更小的碎片，然后在反应中将这些碎片酶连(连接)至克隆载体，所述反应将一个或多个DNA片段插入各载体分子的单个位点(Fitzgerald等,Nucleic Acids Res.14:3753 (1992))。将这一连接混合物引入到大肠杆菌(E.coli)的特定菌株，其中，各细菌细胞对载体及载体上所携带的任何DNA片段进行扩增。将可能包含或不包含插入物的载体DNA从各细胞系中纯化，并用作酶促测序反应的模板(Sanger等，Proc Natl Acad Sci USA74:5463 (1977);Prober 等，Science238:336 (1987) ;Tabor 和 Richarson, Proc Natl Acad Sci USA92:6339 (1995)，将这些文献全部以引用的方式并入本文)。通过自动测序仪对反应产物进行分析，以确定亚克隆的DNA片段的线性序列(Smith等，Nature321:674 (1986)，以引用的方式并入本文)。使用计算机算法来对来自于亚克隆片段文库的数据进行汇编，通常产生原始DNA分子80-95%的序列信息。使用“间隙填补(Gap filling)”技术确定目标DNA剩余的5-20%ο
[0144]下一代测序
[0145]在本文所述的方法和测定法中，本文所考虑的用于对提取的核酸进行测序的另一种方法为“下一代测序”。这些技术产生较短的读段(25-500bp)，但在相对较短的时间(如一天)内产生几十万或上百万的读段。由于这些技术的数据量高且进行全基因组测序所需时间相对较短，因而优于鸟枪法测序。主要缺点是精确度通常较低(虽然这一点由高覆盖度而得以补偿)。
[0146]下一代测序法通常采用并行化进行测序过程的高通量技术，一次产生数千或数百万的序列。高通量测序技术的目的在于最大可能地降低使用标准染料终止子法的DNA测序的成本。下一代测序法和机器的一些非限制性实例包括但不仅限于:大规模平行标签测序(MPSS)、454 焦憐酸测序、454GenomeSequencer FLX 仪(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa)测序、SOLiD 测序、Applied Biosystems ABI SOLiD 系统、Helicos 单分子测序装置(HeliScope)以及1n Torrent System Inc.的1n半导体测序。本领域技术人员可以将这些测序方法以及任何新测序方法应用于本文所述的测定法和方法中。
[0147]宏基因组
[0148]如本领域已知的，术语“宏基因组”定义了给定生境(habitat)(例如，患者样品)的全部有机体的基因组的总体(参见例如，Handelsman等，(1998) Chemistry and Biology5:245-249)。特别是，术语“宏基因组”涉及来自微生物的基因组核酸，优选DNA，所述微生物包括可培养的微生物 和不可培养的微生物(即，不能通过标准方法分离、且不能在标准人工培养基中活性复制无限的时间周期的有机体)。特别地，宏基因组的提取部分中的任何特定的微生物基因组的表现度(representation)不被该微生物的可培养性影响或不依赖于该微生物的可培养性。因此，不可培养的微生物和可培养的微生物的核酸实质上在宏基因组的提取部分中均有所表现。
[0149]相应地，在本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，宏基因组涉及由患者样品中直接获取(extrusion) DNA以及这些DNA在培养的宿主细胞(通常为细菌)中的表达和扩增。宏基因组被首先开发并用于识别新型细菌门(Pacel997)，其基于识别为其关注的系统发育标记物的基因(如16s rDNA基因)的特异性克隆。
[0150]宏基因组更近期的发展关注在未进行任何选择和/或识别的情况下克隆的总体宏基因组，从而建立随机“宏基因组DNA文库”。这提供了，在不进行任何特定选择的情况下获取整个细菌多样性的遗传潜力的路径。通过已被克隆的环境DNA片段，宏基因组DNA文库由数十万彼此不同的克隆组成。在这一方面，已对大DNA片段(超过30KB)进行克隆，从而(i)对需要分析的克隆数量进行限制；以及(ii)使得能够恢复针对由多酶法合成的新型代谢产物的整个生物合成途径。
[0151 ] 将序列与已知微生物的序列进行比较
[0152]在本文所述的测定法和方法的一些实施方式中，将使用任何上述方法或在本领域普通技术人员已知的方法所提取的核酸的序列与已知的微生物序列进行比较，所述已知的微生物序列例如为微生物基因序列的数据库，如GenBank或GreenGenes (万维网网址为greengenes.lbl.gov)(作为16S序列及其注释的文库)；并且，可使用搜索工具(如BLAST)在数据库中查询核酸序列同源性，从而对样品序列进行识别。在一些此类实施方式中，数据库包含来源于微生物群的宏基因组数据。
[0153]如果进行比较的序列的同源性低于20%，则确定所提取并测序的核酸来自先前未特征化的微生物；而如果进行比较的序列的同源性高于20%，则确定所述同源性高于20%的微生物来自于相同的微生物家族。
[0154]疾病和失调
[0155]在一些方面和实施方式中，本文所述的方法和测定法在对患有疾病或失调的受试者或患者中的免疫刺激性微生物的存在进行识别和诊断方面是有用的。
[0156]炎症性肠病
[0157]在一些实施方式中，本文所述的测定法和方法可用于诊断炎症性肠病和/或识别在患有炎症性肠病的受试者中引发免疫响应的微生物。
[0158]炎症性肠病(IBD)被定义为病因不明的慢性、复发性肠炎症。仍未充分了解IBD的病因学。然而，基于对患者的研究和来自结肠炎的转基因动物模型的研究，在如下方面存在着越来越多的共识:结肠炎为由对非致病性肠道细菌的异常响应导致的肠感染。IBD的发病机制中涉及细菌的一些最引人注目的证据来自表明取自Crohn’ s病患者的回肠粘膜活检样品中存在E.coli的研究。尽管缺乏传统的细菌致病性标记物，这些有机体能侵入肠细胞系并宿于巨噬细胞内而不诱导细胞凋亡。其它使用广泛特异性16S核糖体探针进行原位杂交来检测所有种类的细菌的研究发现，UC和CD中的粘液层内存在的未识别的细菌增加。另外，不希望受理论约束或 限制，IBD的遗传基础与所描述的关于响应感染性试剂(如麻风(leprosy))的遗传基础相重叠，提高了如下可能性:IBD作为对外源感染性试剂的响应而产生(N Engl J Med2010)。
[0159]炎症性肠病包括例如Crohn’ s病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet’ s综合征或未定型结肠炎。然而，最常见的炎症性肠病为Crohn’s病和溃疡性结肠炎。这些疾病可能由肠中不受限制的炎症响应活化而导致。这一炎症级联反应某种程度上通过促炎性细胞因子的活化和淋巴细胞亚群的选择性活化而延续。对于IBD患者，肠内壁的溃疡和炎症导致腹痛、腹泻和直肠出血等症状。溃疡性结肠炎在大肠中发生，而在Crohn’ s病中可涉及整个胃肠道(GI tract)以及小肠和大肠。对于大多数患者而言，IBD为症状持续数月至数年的慢性病症。这一疾病最常见于青年成人，但可在任何年龄发生。这一疾病在全世界均有发现，但最常见于工业化国家，如美国、英国和北欧。该病在犹太血统的人中尤其常见，并且其发病率也具有种族差异。IBD的临床症状为间歇性的直肠出血、疫挛性腹痛、体重减轻和腹泻。IBD的诊断根据临床症状、钡灌肠剂的使用进行，但直接目测观察(乙状结肠镜或结肠镜检查)是最准确的测试。拖延性IBD是结肠癌的危险因素，IBD治疗可包括药物和手术。
[0160]一些UC患者仅患有直肠疾病(直肠炎)，而其他患者可以患有限于直肠和相邻的左侧结肠的疾病(直肠乙状结肠炎(proctosigmoiditis))。在一些个体中，UC发生于整个结肠(全结肠炎)。UC的症状通常更严重且疾病更广泛(疾病涉及结肠更大的部分)。类似地，患有限于直肠的直肠炎或仅限于左端结肠(直肠乙状结肠炎)的UC的患者的预后优于疾病涉及整个结肠的受试者的预后。
[0161]在一些情况下，使用口服药物或灌肠剂进行的短暂周期性治疗可能足以在溃疡性结肠炎患者中引起缓解，即，如疼痛、出血和体重减轻的症状消失。对于患有更广泛的疾病的患者而言，发炎的肠道的失血可导致贫血，并可能需要通过补充铁、甚至输血进行治疗。在少数情况下，当炎症变得非常严重时，结肠可急性扩张到大尺寸。这种病症被称为中毒性巨结肠(toxic megacolon)。中毒性巨结肠患者极度病重，伴有发烧、腹痛、腹胀、脱水和营养不良。除非病人利用药物迅速改善，否则通常需要进行手术以防止结肠破裂。
[0162]Crohn’ s病可发生于胃肠道的所有区域。由于炎症和纤维化，很多该病的患者中发生肠梗阻。肉芽肿(Granulomas)和瘘管(fistula)形成是Crohn’ s病的常见并发症。Crohn’ s病的患者在严重情况下可能需要静脉输送营养、手术和结肠造口(colostomy)来对疾病进行适当治疗。
[0163]炎症性肠病患者患结肠癌的风险也有所提高。在IBD8-10年后，癌症的风险开始
显著上升。
[0164]一旦作出阳性诊断，可使用消炎药物(如水杨酸盐/酯)对IBD进行药理学治疗。水杨酸盐/酯制剂在治疗轻度至中度疾病中有效，并且在长期摄入药物时可减少疾病发作(flare)频率。水杨酸盐/酯的例子包括柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、奥沙拉嗪(olsalazine)和美沙拉嗪(mesalamine)。这些药物通常以高剂量口服给予，以实现最大治疗效果。在不响应水杨酸盐/酯或皮质激素(corticosteroids)的IBD患者中，使用抑制免疫系统的药物。免疫抑制剂的例子包括硫唑嘌呤(azathioprine)和6_巯基嘌呤(6-mercaptopurine)。
[0165]自身免疫失调
[0166]在本文的多个方面和实施方式中描述的方法和测定法对于识别与诱发或导致自身免疫失调或自身免疫疾病的新型微生物也可特别有利。广义上所称的“自身免疫疾病”是指这样一类疾病:在该疾病中，受试者的自身抗体与宿主组织反应，或免疫效应因子T细胞与内源性自身肽发生自体反应并 引起组织破坏。由此产生了针对受试者自身抗原(称为自体抗原(se 1 f-antigen ))的免疫响应。本文所使用的术语“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。不希望受理论限制或束缚，认为某些自身免疫疾病在疾病的起始或进展或病因学中，可能涉及额外的、目前尚未识别的微生物病因学试剂、触发子或组分(如细菌、真菌或病毒)。相应地，本文所述的方法可用于患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性的受试者中，其中，免疫蛋白富集部分由受试者的样品获得，核酸由该部分中提取，并对提取的核酸进行测序以识别受试者中的任何免疫刺激性微生物。
[0167]相应地，本文所述的方法和测定法的一些实施方式中，受试者患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性，所述自身免疫疾病包括但不仅限于:类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、Hashimoto’ s甲状腺炎、Goodpasture’ s综合征、天疱疮(例如，寻常天疱疮)、Grave’ s病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原蛋白的抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎、恶性贫血、特发性Addison’ s病、自身免疫相关性不孕不育、肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、Sjogren’s综合征、胰岛素抵抗、以及自身免疫性糖尿病(1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病)。自身免疫性疾病已被认为还涵盖动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。在本文所述的方面的一个实施方式中，自身免疫疾病选自于由如下疾病所组成的组:多发性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲状腺炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胃炎(gastritis)、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球肾炎、Guillain-Barre综合征、牛皮癖和重症肌无力。
[0168]系统
[0169]在其它方面和实施方式中，本文还提供系统(和用于使计算机系统运行的计算机可读介质)，用以执行用于在患者样品中检测和/或识别免疫系统刺激性微生物的方法。 [0170]本文所提供的系统的实施方式可以通过功能模块来进行描述，所述功能模块由记录在计算机可读介质上的计算机可执行指令所定义，并且所述功能模块在执行时使计算机执行方法步骤。为了清楚起见，将本文所述的模块按功能进行区分。然而，应该理解的是，模块/系统不必对应于分散的(discreet)代码块，所描述的功能可以通过存储在多种介质上的不同代码部分执行以及可以在不同时间执行。此外，应该理解的是，这些模块可以执行其它功能，因此所述模块并不仅限于具有任何特定功能或功能组合。
[0171]所述计算机可读存储介质#30可以是能由计算机访问的任何可用的有形介质。计算机可读存储介质包括在用于存储信息(如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据)的任何方法或技术中使用的易失性的(vo 1 at i 1 e )和非易失性的、可移动的和不可移动的有形介质。计算机可读存储介质包括但不仅限于:RAM (随机存取存储器)、ROM (只读存储器)、EPR0M (可擦除可编程只读存储器)、EEPR0M (电可擦除可编程只读存储器)、USB存储器、闪存存储器或其它存储器技术、⑶-ROM (光盘只读存储器)、DVD (数字通用盘)或其它光学存储介质、磁带盒、磁带、磁盘存储器或其它磁性存储介质、云服务器存储系统、其它类型的易失性和非易失性存储器、以及任何其它可用于存储所期望的信息并可通过计算机访问的有形介质，以及前述介质的任何合适的组合。
[0172]一个或多个计算机可读存储介质上体现的计算机可读数据可以定义指令，例如，作为一个或多个程序的一部分，即，作为由计算机执行的结果，指示计算机执行一个或多个本文所述的功能，和/或不同的实施方式、变型和它们的组合。此类指令可以使用多种编程语言中的任何一种编写，例如，Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、C0B0L汇编语言等，或使用多种所述编程语言的组合中的任何一种编写。体现了这样的指示的计算机可读存储介质可以驻存于系统或本文所述的计算机可读存储介质的一个或多个组件之中，或可跨越分布于一个或多个此类组件中。
[0173]所述计算机可读存储介质可以是可传输的，这样使得存储于其上的指令可以被加载至任何计算机资源，以执行本文所讨论的本发明的方面。此外，应当理解的是，如上所述，计算机可读介质中存储的指令并不仅限于体现为在主机上运行的一个应用程序的一部分的指令。相反，所述指令可以体现为可用于对计算机进行编程以实现本发明的各个方面的任何类型的计算机代码(例如，软件或微代码)。计算机可执行指令可以用合适的计算机语言或几种语言的组合进行编写。基本计算生物学方法对于本领域普通技术人员来说是已知的，并在例如 Setubal 和 Meidanis 等，Introduction to Computational BiologyMethods (PWS Publishing Company, Boston, 1997 年)；Salzberg, Searles, Kasif,(主编)，Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998年);Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics -Application in Biological Science and Medicine(CRC Press, London, 2000 年)；以及 Ouelette 和 Bzevanis, Bioinformatics:A PracticalGuide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley&Sons, Inc.,第 2 版，2001 年)中有所描述。
[0174] 在本文所述的系统的一些实施方式中，功能模块至少包括:测定系统#40、存储装置#30、比较模块#80、以及显示模块#110。功能模块可以在一个或多个计算机上执行，或通过使用一个或多个计算机网络执行。测定系统具有计算机可执行指令，从而以计算机可读的形式提供例如序列信息。
[0175]测定系统#40可以包含用于对免疫系统刺激性微生物进行测序的任何系统。如本领域技术人员所知的，此类系统可包括但不仅限于:下一代测序平台、高通量测序平台、PCR或定量PCR机器或装置等。
[0176]在测定系统中测定的信息可通过存储装置#30读取。本文所使用的“存储装置”旨在包括任何合适的计算或处理设备或其它被配置或调整用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例可以包括独立的计算设备、数据通信网络(包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、互联网、内联网以及外联网)、本地和远程服务器、以及本地和分布式计算机处理系统。存储装置还包括但不仅限于:磁性存储介质(如软盘，硬盘存储介质)、远程或本地服务器、磁带、光存储介质(例如CD-ROM、DVD)、电子存储介质(如RAM、ROM、EPROM、EEPR0M)等、普通硬盘以及这些类别的混合(如磁性/光存储介质)。存储装置被调整或配置为在其上记录核酸序列信息。此类信息可通过数字化形式提供，该形式例如可通过互联网、在磁盘(diskette)上、通过USB (通用串行总线)、或通过任何其它合适的通信模式来传输和电子阅读。
[0177]本文所使用的“存储”是指对存储装置上的信息进行编码的过程。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知的方法来将信息记录于已知的介质上，以生成包含有关免疫刺激性微生物的信息的产品。
[0178]在一些实施方式中，存储在存储装置中、待通过比较模块读取的参比数据例如为由从患者样品获得的免疫蛋白富集部分获得的序列数据。
[0179]“比较模块”#80可使用多种可获得的软件程序和格式进行如下比较:将测定系统中测定的序列信息数据与一种或多种参比样品和/或存储的参比数据进行比较。在本文所述的系统的一些实施方式中，比较模块被配置为使用模式识别技术(pattern recognitiontechnique),从而将来自一个或多个条目(entries)的信息与一个或多个参考数据模式进行比较。比较模块可以被配置为使用现有的可商购的或可自由使用的软件来进行模式比较，并可为所实施的特定的数据比较进行优化。比较模块提供了涉及免疫系统刺激性微生物的核酸序列的计算机可读信息。
[0180]比较模块或本发明任何其它的模块可以包括操作系统(例如，UNIX)，在该操作系统上运行相关数据库管理系统、万维网应用程序、以及万维网服务器。万维网应用程序包括生成数据库语言语句所需的可执行代码(如结构化查询语言(SQL)语句)。一般来说，可执行文件将包括嵌入式SQL语句。此外，万维网应用程序可包括配置文件，该配置文件包含对于各种软件实体的指针和地址，所述软件实体包括服务器以及各种外部和内部数据库(必须通过服务用户请求访问)。配置文件还将对服务器资源的请求定向至相应的硬件-这在服务器分布在两个以上分离的计算机上时可能是必要的。在一个实施方式中，万维网服务器支持TCP/IP协议。诸如此类的本地网络有时也被称为“内联网(Intranets)”。此类内联网的优势在于，其允许方便地与驻存在万维网上的公共领域数据库(例如，GenBank或瑞士Pro万维网站点)进行沟通。因此，在一些实施方式中，使用由Web浏览器和Web服务器提供的HTML界面，用户可以直接访问驻存在互联网数据库上的数据(例如通过超文本链接)。
[0181]比较模块提供了计算机可读的比较结果，该结果可通过预定义的标准或由用户定义的标准以使用计算机可读的形式进行处理，从而提供部分基于比较结果的内容，该内容可以根据用户的需求使用显示模块#110进行存储和输出。
[0182]基于比较结果的内容可以是免疫系统刺激性微生物的类别。或者，基于比较结果的内容可以是免疫系统刺激性微生物类别的缺乏，表明该微生物是先前未特征化的微生物。
[0183]在本文所述的系统的一些实施方式中，基于比较结果的内容显示在计算机显示器#120上。在本文所述的系统的一些实施方式中，基于比较结果的内容通过可打印介质#130,#140显示。显示模块可以是任何适当的装置，所述装置被配置为从计算机处接收、并将计算机可读信息显示给用户。非限制性的实例包括，例如，基于下列的通用计算机:IntelPENTIUM 型处理器、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC 处理器，以及可由 Advanced Micro Devices (AMD), Sunnyvale, California 购得的多种处理器、平板或移动电话设备、或任何其它类型的处理器、视觉显示装置如平板显示器、阴极射线管等，以及各种类型的计算机打印机。
[0184]在本文所述的系统的一些实施方式中，万维网浏览器被用来提供用于显示基于比较结果的内容的用户界面。应当理解的是，本发明的其它模块可以调整为具有Web浏览器界面。通过Web浏览器，用户可以创建从比较模块中检索数据的请求。因此，用户通常会指向并点击用户界面元素(如常规使用于图形用户界面中的按钮、下拉菜单、滚动条等)。
[0185]因此，本文所述的方法提供系统(和用于引起计算机系统运行的计算机可读介质)以执行用于在患者样品中检测和/或识别免疫系统刺激性微生物的方法，并任选地执行对患有感染性疾病的患者进行诊断。
[0186]对于在个体中所进行的诊断方法，本文所述的系统和计算机可读介质仅为本发明的示例性实施方式，并不旨在限制本发明的范围。本文所述的系统和计算机可读介质的变型是可能的，并旨在落入本发明的范围内。
[0187]机器的模块或在计算机可读介质中所使用的模块可以承担多种配置。例如，可以在一台机器上提供功能、或者所述功能可分布于多台机器。
[0188]本文公开的一些方面和实施方式可通过例如以下编号段落中的任一项加以说明:
[0189]1.一种用于在患有疾病或失调的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括下列步骤:
[0190](a)由从患者样品获得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；
[0191](b)对提取的核酸进行测序；以及
[0192](c)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否为微生物核酸，其中，若所述提取的核酸为微生物核酸，则所述患者被检测为具有免疫刺激性微生物。
[0193]2.一种用于在患有疾病或失调的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括下列步骤:[0194](a)由患者样品制备免疫蛋白g集部分；
[0195](b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；
[0196](c)对提取的核酸进行测序；以及
[0197](d)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否为微生物核酸，其中，若所述提取的核酸为微生物核酸，则所述患者被检测为具有免疫刺激性微生物。
[0198]3.如段1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有炎症性肠病。
[0199]4.如段3所述的方法，其中，所述炎症性肠病为Crohn' s病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet/ s综合征或未定型结肠炎。
[0200]5.如段1-4中任一项所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有自身免疫失调。
[0201]6.如段1-5中任一项所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有硬化、败
血症或病毒血症。
[0202]7.如段1-6中任一项所 述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白或病原体识别受体具有特异性的亲和结合剂制备。
[0203]8.如段1-7中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特异性的亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
[0204]9.如段1-8中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
[0205]10.如段1-9中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。
[0206]11.如段7-10中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任意组合。
[0207]12.如段7-11中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体,或所述亲和结合剂或抗体的任意组合。
[0208]13.如段7-12中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0209]14.如段7-13中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂未结合至固相载体。
[0210]15.如段7-13中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂结合至固相载体。
[0211]16.如段15所述的方法，其中，所述固相载体包括超顺磁微珠、微尺度琼脂糖珠、或琼脂糖树脂珠。
[0212]17.如段1-16中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
[0213]18.如段1-17中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
[0214]19.如段1-18中任一项所述的方法，其中，所述患者样品为血液样品、血浆样品、尿样品、脑脊液样品、粘膜样品、粪便样品、肠灌洗样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰样品或支气管肺泡灌洗液样品。
[0215]20.如段19所述的方法，其中，所述肠灌洗样品为回肠灌洗样品。
[0216]21.如段1-20中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为先前未特征化的微生物。
[0217]22.如段1-21中任一项所述的方法，其中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆、16SrRNA/DNA扩增和/或宏基因组测序进行。
[0218]23.如段1-22中任一项所述的方法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用微生物基因特异性引物进行。
[0219]24.如段1-22中任一项所述的方法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用非基因特异性引物进行。
[0220]25.如段1-24中任一项所述的方法，其中，用于从中制备所述免疫蛋白富集部分的所述患者样品在所述提取核酸的步骤之前并未进行培养步骤。
[0221]26.一种用于在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括下列步骤:
[0222](a)由从患者样品制备的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0223](b)对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
[0224]27.一种用于在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括下列步骤:
[0225](a)从患者样品制备免疫蛋白g集部分；
[0226](b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0227](c)对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
[0228]28.如段26或27所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白或病原体识别受体具有特异性的亲和结合剂制备。
[0229]29.如段26-28中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特异性的亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
[0230]30.如段26-29中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
[0231]31.如段26-30中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。
[0232]32.如段31所述的测定法，其中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任意组合。
[0233]33.如段31或32所述的测定法，其中，所述亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体。
[0234]34.如段28-33中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0235]35.如段28-34中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂未结合至固相载体。[0236]36.如段28-34中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂结合至固相载体。
[0237]37.如段36所述的测定法，其中，所述固相载体包括超顺磁微珠、微尺度琼脂糖珠、或琼脂糖树脂珠。
[0238]38.如段26-38中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
[0239]39.如段26-39中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
[0240]40.如段26-40中任一项所述的测定法，其中，所述患者样品为血液样品、血浆样品、尿样品、脑脊液样品、粘膜样品、粪便样品、肠灌洗样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰样品或支气管肺泡灌洗液样品。
[0241]41.如段40所述的测定法，其中，所述肠灌洗样品为回肠灌洗样品。
[0242]42.如段26-41中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为先前未特征化的微生物。
[0243]43.如段26-42中任一项所述的测定法，其中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆、16SrRNA/DNA扩增和/或宏基因组测序进行。
[0244]44.如段26-43中任一项所述的测定法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用微生物基因特异性 引物进行。
[0245]45.如段26-43中任一项所述的测定法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用非基因特异性引物进行。
[0246]46.如段26-45中任一项所述的测定法，其中，用于从中制备所述免疫蛋白富集部分的所述患者样品在所述提取核酸的步骤之前并未进行培养步骤。
[0247]47.如段26-47中任一项所述的测定法，其中，所述微生物不能使用标准培养条件进行培养。
[0248]48.一种用于由至少一个测试样品获取数据的系统，所述测试样品包含由免疫蛋白富集样品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集样品由至少一名患者处获得，所述系统包含:
[0249]a.测定模块，所述测定模块被配置用于接收包含所述提取的核酸的所述至少一个测试样品，并对所述至少一个测试样品进行至少一次测序分析，以产生测序数据输出；
[0250]b.存储装置，所述存储装置被配置用于存储来自所述测定模块的所述测序数据输出；
[0251]c.比较模块，所述比较模块被配置用于接收包含提取的核酸的所述测试样品的所述测序数据输出，并对所述测序数据输出进行至少一次测序分析，以确定下列条件之一存在与否，并产生比较数据输出:
[0252]1.所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上；或者
[0253]i1.所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20%;
[0254]以及
[0255]d.显示模块，所述显示模块用于对部分基于来自所述比较模块的所述比较数据输出的内容进行显示，其中，所述内容包括表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上的信号；或者表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信号。
[0256]49.如段46所述的系统，其中，所述显示模块上显示的内容进一步包括表明建议接受特定治疗方案的患者的信号。
[0257]实施例
[0258]本文提供了对先天或适应性免疫系统响应的微生物进行直接识别的测定法和方法。哺乳动物宿主(人类和非人类)中生长着多种多样的共生微生物或致病微生物。免疫系统的响应是共生微生物或病原微生物的指纹。目前的微生物学方法并不必然将对生物体的免疫响应作为直接识别生物体的手段而纳入考量。免疫响应被定义为基于免疫响应的存在直接显示微生物的证据。作为结果，微生物的存在通常通过培养或类似类型的生物测定法来确定。本文所述的测定法和方法将免疫响应与微生物的直接检测相结合，用于诊断和识别特定的感染性疾病、特别是其中的有机体无法被培养的疾病的目的。此外，这一方法能够直接应用于范围广泛的体液直接测定法。
[0259]在一些实施方式中，本文所述的测定法和方法包括通过多种不同手段(例如蛋白A或蛋白G琼脂糖、IgG的Fc片段的特异性抗体)直接由体液(例如肠液、血液、关节液、脑脊液)对IgG分子进行直接免疫沉淀。一旦沉淀，直接由免疫沉淀物提取核酸。可利用设计用于检测特定微生物的引物对DNA进行测序、或可进行16S rRNA/DNA扩增或鸟枪法克隆以及宏基因组测序，从而在跨越原核界和真核界的频谱中搜索微生物。因此，本文所述的测定法和方法将免疫响应的选择性与DNA测序的灵敏度和特异性相结合。通过首先将核糖核酸转化为互补的DNA或使免疫沉淀针对免疫响应的其它组分(如IgM、IgE、IgA和IgD或甚至先天性免疫响应的组分(如补体))，这一方法可适于对这些核糖核酸进行的测序。本文所述的测定法和方法也具有广泛的兽医应用、以及在对遗传物质并非DNA而是RNA的有机体进行识别中的应用、并且适合逆转录。
[0260]例如，图1A-图1C和图2A-图2C表明，如使用一系列示出了回肠灌洗样品中细菌比例的饼形图所示的，由回肠灌洗样品识别的微生物群随它们被分离的方法不同而不同。图1A示出患者的回肠灌洗样品；图1B示出使用未包覆珠进行免疫沉淀的相同回肠灌洗样品(即，对照)；图1C示出通过使用抗人IgG包覆珠进行回肠灌洗样品的免疫沉淀而制备的IgG富集部分。在IgG富集部分和对照非包覆珠部分之间，观测到10个PCR循环的丰度差异(即，IgG珠中的富集与对照珠中相比超出1000倍)。在由肠灌洗和灌入进行如本文所述的免疫沉淀程序后，由抗IgG珠和对照珠中分离DNA ;使用附着有适当的衔接子和接头的扩增16S DNA的V2区域的引物来生成文库，随后在454测序仪上对其进行测序。图1A-图1C显示基于V2同源序列并使用公共数据库的分配至个体操作分类单元0TU的序列的相对丰度，所述数据库如万维网上的greengenes.lbl.gov(在相比于对照沉淀灌洗和灌入的抗IgG免疫沉淀灌洗中)。为允许定性比较，对照未包覆珠免疫沉淀的DNA比IgG珠的DNA扩增更多倍。在灌洗中的细菌群落在组成上与以对照珠沉淀的细菌群落非常相似，但与由IgG珠下拉的细菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的术语，IgG富集部分中识别的细菌为“免疫系统刺激性微生物”。对于在回肠灌洗样品识别的细菌群落，图2A-图2C显示了类似的结果。
[0261]本文所述的方法的优点之一在于，它是用于识别微生物的非培养方法，免疫系统的一个或多个臂(arm)对所述微生物产生特异性响应，并因此与宿主具有生物相关性，而不需要在先或在后的培养步骤。所述测定法也可自动化进行，形成高通量模式。使用本文所述的方法和测定法对免疫系统刺激性微生物进行测序的能力允许对微生物进行直接检测，从而用于对特定感染性疾病、尤其是其中的生物体无法培养的疾病进行诊断和识别。例如，如图3所示，使用本文所述的方法的实施方式，来自患有炎症性肠病的患者的小肠分泌物的IgG包覆的细菌被特异性下拉并测序(使用来自免疫沉淀物的16s rDNA)。由16S rDNA的特异性引物，通过基于SYBR绿的定量实时PCR对16S rDNA的丰度(表示附着于抗IgG珠和对照珠的细菌的丰度)进行定量。IgG富集部分中的细菌相对于对照(灌洗，未包覆珠)而言是特异性的，并以两个以上的数量级(或大于100倍)富集。免疫沉淀物也可包含不可培养的微生物，这可需要下一代测序以及鸟枪法、宏基因组、下一代测序。
[0262]如图4A-图4C所示，本文所述的方法和测定法也可用于在使用常规方法时被认为是无菌的样品中识别病毒。如本文所述，使用抗IgG或对照对来自HCV感染患者(图4A和图4C中的个体患者)的血清进行免疫沉淀，并由抗hlgG免疫沉淀物和对照沉淀物分离RNA。对RNA进行逆转录，并使用特异性引物测试HCV cDNA是否存在。如图4C中所示(与图4A为相同样品)，在抗hlgG免疫沉淀物中检测到HCV信号的184倍和117倍的富集，对照沉淀物中则几乎不存在信号。这些附图表明，本文所述的免疫沉淀程序还可应用于“无菌”环境(如外周血)；并且表明了，如本文所述，使用特异性检测这一 HCV阳性供体内的HCV RNA的引物，能够沉淀完全的病毒。可随后通过任何基于测序的手段检测扩增产物，例如，在病毒的情况下使用宏基因组手段、或对于细菌的情况使用宏基因组手段或基于16S的手段等。
[0263]这些测定法和方法对于(新发)感染性疾病的新型病原体识别以及常规(目前定义的)感染性疾病的诊断方法方面是有用的。本文所述的方法允许非常快速的诊断以及对生物体在体内的生物学特性(例如抗 生素/抗病毒剂耐药性)进行实时检测的机会。
【权利要求】
1.一种用于在患有疾病或失调的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括下列步骤: (a)由患者样品制备免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸； (c)对提取的核酸进行测序；以及 (d)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否为微生物核酸，其中，若所述提取的核酸为微生物核酸，则所述患者被检测为具有免疫刺激性微生物。
2.一种用于在患有疾病或失调的患者中对免疫刺激性微生物的存在进行识别或检测的方法，所述方法包括下列步骤: (a)由从患者样品获得的免疫蛋白富集部分中提取核酸； (b)对提取的核酸进行测序；以及 (c)将所述提取的核酸的序列与已知的微生物核酸序列进行比较，以识别由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否为微生物核酸，其中，若所述提取的核酸为微生物核酸，则所述患者被检测为具有免疫刺激性微生物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有炎症性肠病。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述炎症性肠病为Crohn's病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet' s综合征或未定型结肠炎。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有自身免疫失调。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述患有疾病或失调的患者患有硬化、败血症或病毒血症。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白或病原体识别受体具有特异性的亲和结合剂制备。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对1gA, 1gD, 1gE, 1gG, IgM具有特异性的亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任意组合。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体，或所述亲和结合剂或抗体的任意组合。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂未结合至固相载体。
15.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，所述亲和结合剂结合至固相载体。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述固相载体包括超顺磁微珠、微尺度琼脂糖珠、或琼脂糖树脂珠。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述患者样品为血液样品、血浆样品、尿样品、脑脊液样品、粘膜样品、粪便样品、肠灌洗样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰样品或支气管肺泡灌洗液样品。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述肠灌洗样品为回肠灌洗样品。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为先前未特征化的微生物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆、16SrRNA/DNA扩增和/或宏基因组测序进行。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用微生物基因特异性引物进行。
24.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用非基因特异性引物进行。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，用于从中制备所述免疫蛋白富集部分的所述患者样品在所述提取核酸的步骤之前并未进行培养步骤。
26.一种用于在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括下列步骤: Ca)由从患者样品制备的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (b)对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
27.一种用于在患者样品中对免疫系统刺激性微生物进行直接检测的测定法，所述测定法包括下列步骤: (a)从患者样品制备免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (c)对存在于所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸进行测序，从而获得存在于所述患者样品中的任何免疫系统刺激性微生物的序列。
28.如权利要求26或27所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对免疫球蛋白、补体蛋白或病原体识别受体具有特异性的亲和结合剂制备。
29.如权利要求26-28中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特异性的亲和结合剂或所述亲和结合剂的任意组合制备。
30.如权利要求26-29中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用对IgG具有特异性的亲和结合剂制备。
31.如权利要求26-30中任一项所述的测定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通过使用亲和结合剂利用免疫沉淀制备。
32.如权利要求31所述的测定法，其中，所述亲和结合剂为蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特异性抗体或其片段，或所述亲和结合剂的任意组合。
33.如权利要求28-32中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂或免疫蛋白特异性抗体包括抗人IgG抗体。
34.如权利要求28-33中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂对免疫球蛋白免疫蛋白具有特异性，并结合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
35.如权利要求28-34中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂未结合至固相载体。
36.如权利要求28-34中任一项所述的测定法，其中，所述亲和结合剂结合至固相载体。
37.如权利要求36所述的测定法，其中，所述固相载体包括超顺磁微珠、微尺度琼脂糖珠、或琼脂糖树脂珠。
38.如权利要求26-38中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为细菌、真菌或病毒。
39.如权利要求26-39中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物属于分类单元中的古细菌域、细菌域或真核生物域。
40.如权利要求26-40中任一项所述的测定法，其中，所述患者样品为血液样品、血浆样品、尿样品、脑脊液样品、粘膜样品、粪便样品、肠灌洗样品、肠液样品、关节液样品、呼吸道痰样品或支气管肺泡灌洗液样品。
41.如权利要求40所述的测定法，其中，所述肠灌洗样品为回肠灌洗样品。
42.如权利要求26-41中任一项所述的测定法，其中，被检测的所述免疫系统刺激性微生物为先前未特征化的微生物。
43.如权利要求26-42中任一项所述的测定法，其中，所述测序步骤使用鸟枪法克隆、16S rRNA/DNA扩增和/或宏基因组测序进行。
44.如权利要求26-43中任一项所述的测定法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用微生物基因特异性引物进行。
45.如权利要求26-43中任一项所述的测定法，其中，步骤(b)或步骤(c)中的所述测序使用非基因特异性引物进行。
46.如权利要求26-45中任一项所述的测定法，其中，用于从中制备所述免疫蛋白富集部分的所述患者样品在所述提取核酸的步骤之前并未进行培养步骤。
47.如权利要求26-47中任一项所述的测定法，其中，所述微生物不能使用标准培养条件进行培养。
48.一种用于由至少一个测试样品获取数据的系统，所述测试样品包含由免疫蛋白富集样品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集样品由至少一名患者处获得，所述系统包含: a.测定模块，所述测定模块被配置用于接收包含所述提取的核酸的所述至少一个测试样品，并对所述至少一个测试样品进行至少一次测序分析，以产生测序数据输出； b.存储装置，所述存储装置被配置用于存储来自所述测定模块的所述测序数据输出； c.比较模块，所述比较模块 被配置用于接收包含提取的核酸的所述测试样品的所述测序数据输出，并对所述测序数据输出进行至少一次测序分析，以确定下列条件之一存在与否，并产生比较数据输出:. 1.所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上；或者 ?.所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20% ； 以及 d.显示模块，所述显示模块用于对部分基于来自所述比较模块的所述比较数据输出的内容进行显示，其中，所述内容包括表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性为20%以上的信号；或者表明所述提取的核酸的序列与已知微生物家族的序列的同源性低于20%的信号。
49.如权利要求46所述的系统，其中，所述显示模块上显示的内容进一步包括表明建议接受特定治疗方案的 患者的信号。
【文档编号】G01N33/68GK103635591SQ201280015562
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年1月26日 优先权日:2011年1月26日
【发明者】阿瑟·卡泽尔, 理查德·布隆伯格 申请人:布里格姆及妇女医院股份有限公司, 因斯布鲁克医科大学