一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，利用物理、化学和酶等多种方法配合对细胞壁进行裂解，使之能够最大限度释放微生物DNA，特别是对革兰氏阳性菌有很好的裂解效果；另外，本发明所用的化学试剂都是实验室常备的，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的高通量测序结果能够比较准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
【专利说明】一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物实验技术，尤其是一种用于评价反刍动物瘤胃微生物群落多样性 的DNA提取方法。
【背景技术】
[0002] 反刍动物瘤胃内存在着丰富的微生物菌群，这些微生物菌群能够通过发酵，将难 以消化的纤维素转化为可以被小肠吸收的蛋白质、氨基酸、糖类、酸类和脂类等，为反刍动 物提供营养物质。另外，这些微生物对机体的免疫、生长发育等方面也有着巨大的影响。因 此，它们的分离和鉴定对于研究瘤胃菌群功能具有重要作用。此外，瘤胃微生物作为一个巨 大的基因库，探索其中具有应用价值的基因，可以应用于农牧业，医疗保健，生物化工等方 面，从而更好地为人类服务。
[0003] 传统分离瘤胃微生物的方法主要是通过选择性培养基分离法。由于培养条件 的限制，迄今为止，瘤胃中微生物只有小部分能够被培养，绝大多数还不为人所知。近 年来，随着分子生物学技术的发展，产生了一些新的微生物研究方法，如：变性梯度凝胶 电泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)，末端限制性片段长度多态性 (Terminal restriction fragment length polymorphisms, T-RFLP)以及高通量测序方法 (high throughput sequencing technology)这些方法突破了微生物分离培养的限制，能 够用于全面分析自然界的微生物类群及充分挖掘基因资源。然而，对于这些基于核酸技术 来分析样本微生物结构的方法，DNA提取的质量好坏，会直接影响到微生物群落结构分析结 果。因此，探索简便、高效、低成本的DNA提取方法将是研究瘤胃微生物菌落结构研究所面 临的重要难题。
[0004] 牦牛大多生活在高海拔，低氧，低温，采食恶劣的环境中，由于所处的恶劣让牦牛 消化系统更加高效和稳定，保障其生存和繁衍。再加上如今经济全球化，环境污染和生物 入侵日渐加重，青藏高原作为地球上不多的未受大规模污染的地方，不论生态环境还是饲 养方法都是出于比较原始的状态。牧区由于畜牧医疗技术的相对落后及抗生素等药物的慎 用，保证了牦牛瘤胃中的大量微生物是处在原始状态，未受到人为因素影响的。因此，牦牛 也是研究瘤胃微生物群落结构的最好的模式动物。另外，与规模舍饲养殖的牛群相比，由于 特殊的采食环境，牦牛瘤胃内往往含有大量的腐殖质和泥沙，这些物质会对DNA提取产生 影响并增加基因组提取的难度，因此探索一套适合于牦牛瘤胃微生物DNA提取方法具有重 要意义。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的提供一种更适合的牦牛瘤胃微生物结构 多样性的DNA提取方法，使之更为准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
[0007] -种用于分析牦牛瘤胃微生物群落多样性提取方法，包括以下步骤：
[0008] (1)向0. 5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4°C样品洗涤液A，涡旋振荡lmin4°C离 心机，1000r/min，离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4°C 5ml 洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中 加入4°C 5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液。所有上清液于4°C， 12000r/min离心lOmin，小心倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥 土混合物的沉淀层。
[0009] (2)微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置 于58°C恒温摇床孵育lh。
[0010] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin。
[0011] 加入〇. lg直径为〇. 2mm beads,放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交 替震荡3min。
[0012] 加入溶菌酶3mg，颠倒混匀，放置于37°C恒温摇床，孵育lh。
[0013] 加入等体积（氯仿：异戊醇=24:1)，混匀后放于冰上静置，3min，12000r/min抽提 蛋白质。
[0014] 吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积（苯酚：氯仿：异戊醇= 25:24:1)混 匀于冰上静置3min。
[0015] 12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积 (氯仿：异戊醇=24:1),混匀后放于冰上静置5min。
[0016] 12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇， 重悬，室温放置5min。
[0017] 12000r/min 离心 lOmin，加入 1Π 11701%冰乙醇洗漆。
[0018] 12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解。
[0019] 加入3ul RNA酶，37°C，静置lh，获得纯度较高的DNA溶液。
[0020] 用分光光度计对DNA溶液浓度和纯度进行测定，结果表0D260/0D230 = 1. 93， 0D260/0D280 = 1. 85,均接近标准值（DNA 溶液 0D260/0D230 标准值为 2. 0,0D260/0D280 = 1. 8)，DNA量达到0. 5ug-2ug (达到了后续相关高通量测序对DNA量要求）；以0. 8 %琼脂糖 凝胶电泳，λ DNA作为对照，检测所提取DNA片段完整性，电泳结果发现所提取的DNA具有 较好的完整性。
[0021] 上述步骤中的洗涤液Α为PBS缓冲液，可以避免渗透压不同而造成的细胞裂解。
[0022] 上述步骤中的裂解缓冲液B为TE缓冲液（pH = 7)，可以维持后续反应的最佳理化 条件。
[0023] 上述步骤中的CTAB裂解液浓度为10 %。
[0024] 上述步骤中的蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml。
[0025] 上述步骤中的NaCl溶液为5mol/L。
[0026] 本发明是利用物理、化学和酶等多种方法对细胞壁进行裂解，从而能够最大限度 释放微生物DNA，特别是对革兰氏阳性菌有很好的裂解效果；另外，本发明所用的化学试剂 都是实验室常备的，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的高通量测序结果能够比较准 确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明提取的牦牛瘤胃微生物基因组DNA电泳图谱。
[0028] 图2为不同DNA提取方法得到的牦牛瘤胃微生物群体结构分布图（在门分类水平 上）。图中可以看出不同DNA基因组提取方法所得到的微生物结构存在差异。
[0029] 图3为不同DNA提取方法得到牦牛瘤胃微生物群体结构Heat-map比对图，为基于 样品丰度前50的瘤胃细菌群体的热图。Heat-map中，其用颜色深浅来表示所代表数值大 小，通过颜色直观变化，可以反映不同DNA提取方法之间微生物群体结构数据差异.图中可 以看出本发明（方法6)提取的瘤胃微生物的基因组能够较真实全面反映瘤胃内部微生物 结构。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合具体实例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0031] Nac 1、Kc 1、Na2HP04、KH2P04、CTAB、碱性饱和酚、氯仿、异戊醇等试剂均为国产分析纯 试剂，蛋白酶K，溶菌酶均为进口生物纯试剂。
[0032] 实施例1 :瘤胃内容物采集
[0033] 用灭菌手术刀，在刚从宰杀牦牛体内取出的瘤胃背部打开约10CM的平整外翻切 口。带一次性灭菌手套，支撑切口，采样者手戴一次性灭菌手套，持已经灭菌50ml离心管， 在未打开的情况下，探入瘤胃中开盖，充分搅动样品使瘤胃内容物能够充分混匀，装入离心 管。离心管装满后，应当在瘤胃中立即盖严，然后取出，迅速投入干冰当中冻存，迅速带回实 验室于-80°C冰箱中保存。
[0034] 实施例2 :微生物菌体获得
[0035] 为了保证微生物DNA中没有过多的动植物细胞DNA污染，微生物菌体沉淀的获得 后续获得高质量微生物DNA的前提。向0. 5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4°C样品洗涤液A， 润旋振荡lmin4°C离心机，1000r/min，离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离 心管中加入4°C 5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃 内容物的离心管中加入4°C 5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液。所 有上清液于4°C，12000r/min离心lOmin，小心倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微 生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层。
[0036] 实施例3 :微生物基因组提取
[0037] 微生物菌体团里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于 58°C恒温摇床孵育lh。
[0038] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin ;
[0039] 加入0. lg直径为0. 2mm beads,放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交 替震荡3min。
[0040] 加入溶菌酶3mg，颠倒混匀，放置于37°C恒温摇床，孵育lh。
[0041] 加入等体积（氯仿：异戊醇=24:1)，混匀后放于冰上静置，3min，12000r/min抽提 蛋白质。
[0042] 吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积（苯酚：氯仿：异戊醇= 25:24:1)混 匀于冰上静置3min。
[0043] 12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积 (氯仿：异戊醇=24:1),混匀后放于冰上静置5min.
[0044] 12000r/min离心5min，吸取上清液放置于新的离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇， 重悬，室温放置5min.
[0045] 12000r/min 离心 lOmin，加入 lml70%冰乙醇洗涤
[0046] 12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解，
[0047] 加入3ul RNA酶，37°C，静置lh，获得纯度较高的DNA溶液。
[0048] 实施例3DNA浓度、纯度及完整性检测
[0049] 采用分度光度计对提取的DNA溶液纯度、浓度进行检查。结果表明：0D260/0D230 =1. 93, 0D260/0D280 = 1. 85,均接近标准值（DNA 溶 0D260/0D230 标准值为 2. 0, 0D260/ 0D280 = 1.8)，DNA量达到0. 5ug-2ug (达到了后续相关高通量测序对DNA量要求）。以 0.8%琼脂糖凝胶电泳，入〇嫩作为1&^1?^，电压为15(^，电泳时间为451^11，对提取的0嫩 片段完整性进行检查，如图1所示，电泳结果发现所提取的DNA具有较好的完整性。
[0050] 实施例416rDNA PCR扩增及高通量测序分析
[0051] 对实施例2中提取的DNA进行16S rDNA的PCR扩增并对扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测。16S rDNA 通用引物（338F:5, -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' ；806R:5' -GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'），PCR产物送至深圳华大基因研究院进行高通量测序及数据分析。基于 Illumina MiSeq PE300(Illumina，USA)测序平台，对瘤胃基因组进行16S rR NA高通量测 序。Miseq测序得到的raw reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质 控和过滤。序列过滤后，将那些具有高度相似性（97%)的序列归为一个OTU(Operational Taxonomic Unit)，同时，RDP(Ribosomal Database Project)数据库被用于物种分类学分 析。基于以上分类学信息，ACE丰度指数及Shannon多样性指数被估算出来，具体测序信息 见表1，从表1中可以看出本发明提取的DNA具有较高的微生物群体多样性及丰度指数。
[0052] 表1本发明提取牦牛瘤胃微生物DNA相关16S rDNA测序信息
[0053]
【权利要求】
1. 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，包括以下步骤： (1) 向0. 5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4°C样品洗涤液A，涡旋振荡lmin，4°C离心机， 1000r/min，离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4°C 5ml洗涤 液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入 4°C 5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡lmin，吸取上清液；所有上清液于4°C，12000r/ min离心lOmin，倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的 沉淀层； (2) 微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于 58°C恒温摇床孵育lh ; 加入lOOul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65°C水浴lOmin; 加入0. lg直径为0. 2mm beads,放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震 荡 3min ; 加入溶菌酶3mg，颠倒混匀，放置于37°C恒温摇床，孵育lh ; 加入等体积（氯仿：异戊醇=24:1)，混勻后放于冰上静置，3min, 12000r/min抽提蛋白 质； 吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1)混匀于 冰上静置3min ; 12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积（氯仿： 异戊醇=24:1),混匀后放于冰上静置5min ; 12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇，重 悬，室温放置5min ; 12000r/min离心lOmin，加入lml70%冰乙醇洗涤； 12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解； 加入3ul RNA酶，37°C，静置lh，获得目标纯度DNA溶液。
2. 根据权利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，其特 征在于，所述洗涤液A为PBS缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，其特 征在于，所述裂解缓冲液B为TE缓冲液（pH = 7)。
【文档编号】C12Q1/04GK104099323SQ201410341823
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】兰道亮, 李键, 陈亚冰, 汤承, 熊显荣, 刘洛川 申请人:西南民族大学