一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂的制作方法
【专利摘要】一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，涉及一种乳酸菌复合菌剂。本发明是要解决现有的发酵工艺无法兼顾发酵时间短和风味、品质佳的问题。该乳酸菌复合菌剂的活性成分包括Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri和Lactobacillus oligofermentans。所述菌剂具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，不仅可以使蔬菜迅速进入发酵状态，且能在发酵体系中快速繁殖产乳酸、乙酸、乙醇等风味物质，使人工发酵蔬菜接近自然发酵风味，且操作简易、成本低廉。用于发酵白菜、圆白菜、萝卜、黄瓜等蔬菜。
【专利说明】一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乳酸菌复合菌剂。
【背景技术】
[0002] 传统发酵蔬菜是我国蔬菜加工产品中产量最多的一种，是利用天然存在的乳酸菌 等微生物进行发酵制作而成的。大约3000年前，我国就有了发酵蔬菜的制作工艺，如四川 泡菜、榨菜、扬州酱菜等。随着现代食品工业的发展以及消费者对食品安全和健康要求的不 断提高，迫切需要生产低盐、低亚硝酸盐含量的发酵蔬菜，实现生产加工的标准化、规模化， 人工发酵蔬菜完全可以满足人们的这些要求。
[0003] 目前美国、日本、韩国等发达国家的发酵蔬菜加工多采用人工发酵，并实现规模化 生产，而我国大部分的产品还是自然发酵，由于发酵过程中微生物区系复杂多变，导致发酵 进程难以控制，产品质量波动不定，严重制约蔬菜发酵产业的规模化发展。
[0004] 东北酸菜是传统发酵蔬菜食品，以白菜为主要发酵原料，其味道咸酸，口感脆嫩， 开胃提神，醒酒去腻，不但能增进食欲、帮助消化，还可以促进人体对铁元素的吸收。过去， 在我国东北和华北等地，由于冬季时间长，鲜菜不宜贮藏，为了将白菜长期保存起来，人们 发明了腌制酸菜的方法。随着酸菜知名度的提高以及现代生活节奏的加快，对其需求量越 来越大，质量要求也越来越高，传统自然发酵的方法已经满足不了人们的需求，需求的不断 扩大加速了酸菜生产的规模化。
[0005] 然而，至今为止，整个东北酸菜的加工企业依然多采用传统的发酵池进行自然发 酵，存在发酵周期长、产品品质差、质量不稳定等问题。人工接种发酵工艺具有发酵时间短、 受季节影响小、品质易于控制的特点，但是其风味上不及自然发酵的酸菜自然、醇厚。因此， 采用人工可控的方式进行发酵，使其风味逐步接近自然发酵是东北酸菜规模化生产需要不 断努力的目标。
【发明内容】
[0006] 本发明是要解决现有的发酵工艺无法兼顾发酵时间短和风味、品质佳的问题，提 供一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂。
[0007] 本发明用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂的活性成分包括Lactobacillus sunkii、 Lactobacillus curvatus、 Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus o1i gofermentans 〇
[0008] 所述乳酸菌复合菌剂中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、 Lactobacillusparabnchneri 矛口 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成单位数目比 为（1 ?3) : (4 ?6) : (4 ?6) : (1 ?3)。
[0009] 所述 Lactobacillus sunkii 具体可为 Lactobacillus sunkii DSM19904 ; 所述 Lactobacillus curvatus 具体可为 Lactobacillus curvatus DSM20019 ;所述 Lactobacillus parabuchneri 具体可为 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 具体可为 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。
[0010]所述乳酸菌复合菌剂中，Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、 Lactobacillus parabuchneri>Lactobacillus oligofermentans 可分别独立包装，也可混 合在一起。
[0011] 本发明的乳酸菌复合菌剂可以为液体制剂，包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性 成分、甘油和EDTA的配比为（1?L 2) X 10nCFU : (1?5) g甘油：lgEDTA。
[0012] 本发明的乳酸菌复合菌剂可以为固体制剂，菌剂的生产采用冻干法，即将培养好 的菌液离心，转速5800g离心10min，弃上清，将冻干保护剂加入，加入比例按菌液与保护剂 的体积比为5 : 1，于-20°C冷冻10h，之后在压力为3?5Pa、温度为-50°C条件下冷冻干燥 24h得冻干的菌粉。
[0013] 本发明所述菌剂可以发酵白菜为酸菜。
[0014] 本发明所述菌剂优先但不仅限于发酵白菜，其发酵对象还包括圆白菜、萝卜、黄瓜 等蔬菜。所述菌剂具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，不仅可以使蔬菜迅速进 入发酵状态，且能在发酵体系中快速繁殖产乳酸、乙酸、乙醇等风味物质，使人工发酵蔬菜 接近自然发酵风味，且操作简易、成本低廉。
【具体实施方式】
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0016] 一：本实施方式用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂的活性成分包 括 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans。
【具体实施方式】 [0017] 二：本实施方式与一不同的是：所述乳酸菌复合菌剂 中 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans的集落形成单位数目比为（1?3) : (4?6) : (4? 6) : (1?3)。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0018] 三：本实施方式与二不同的是：所述乳酸菌复合菌 剂中 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和Lactobacillus oligofermentans的集落形成单位数目比为1 : 4 : 4 : 1或 1 : 2 : 2 : 1。其它与二相同。
【具体实施方式】 [0019] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：所述 Lactobacillus sunkii 为 Lactobacillus sunkii DSM19904 ；所述 Lactobacillus curvatus 为 Lactobacillus curvatus DSM20019 ；所述 Lactobacillus parabuchneri 为 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 为 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0020] 五：本实施方式与一至四之一不同的是：所述乳 酸菌复合菌剂包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性成分、甘油和EDTA的配比为（1? 1.2)X10 nCFU : (1?5)g甘油：lgEDTA。其它与一至四之一相同。
[0021]
【具体实施方式】六：本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是：所 述乳酸菌复合菌剂包括活性成分和脱脂乳粉，所述活性成分和脱脂乳粉的配比为 (1-1.2)X108CFU : (1?6)g脱脂乳粉。其它与【具体实施方式】一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0022] 七：本实施方式与一至六之一不同的是：所述乳酸菌 复合菌剂在发酵白菜、圆白菜、萝卜或黄瓜中的用途。其它与一至六之一相 同。
[0023] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0024] 实施例1、发酵菌剂中活性成分的筛选。
[0025] MRS液体培养基的组成：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖20g， K2HP042g，柠檬酸二铵 2g，无水乙酸钠 5g，吐温 80ml，MgS04 · 7Η200· 58g，MnS04 · 4Η200· 25g， ρΗ6· 2 ?64,蒸馈水 1000ml。
[0026] 取东北三个地区传统酸菜发酵液5ml分别接入到95ml MRS培养基中，于5°C冰箱 中厌氧培养l〇d。
[0027] 10d后，分别取上述三种培养液各5ml，或相互组合总体积为5ml的培养物接入 95ml新鲜的MRS培养基中，每4d转接一次，连续继代培养。测定培养液的pH值、乳酸、乙酸 和乙醇的产量。选择pH值下降迅速，产乳酸、乙酸、乙醇较多且对外界环境变化相对稳定的 培养物，筛选其中的活性成分。
[0028] 通过变性梯度凝胶电泳（DGGE)和16S rDNA克隆文库对上述获得的培养物进行 研究，结果表明，上述培养物中的组成菌主要为Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri> Lactobacillus oligofermentans。
[0029] 实施例2、制备液体乳酸菌复合菌剂，用于白菜发酵。
[0030] 一、菌剂的制备
[0031] 菌株活化：将 Lactobacillus sunkii DSM19904、Lactobacillus curvatus DSM20019、 Lactobacillus parabuchneri DSM20173、 Lactobacillus oligofermentans DSM15707 分别接到 MRS 固体培养基上，Lactobacillus sunkii DSM19904、Lactobacillus curvatus DSM20019、Lactobacillus parabuchneri DSM20173 于 30 °C 培养 2d， Lactobacillus oligofermentans DSM15707 于 25°C培养 2d。
[0032] MRS固体培养基的组成：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖20g， K2HP042g，柠檬酸二铵 2g，无水乙酸钠 5g，吐温 80ml，MgS04 · 7Η200· 58g，MnS04 · 4Η200· 25g， 琼脂 15g，ρΗ6· 2 ?6. 4,蒸馈水 1000ml。
[0033] Lactobacillus sunkii DSM19904、 Lactobacillus curvatus DSM20019、 Lactobacillus parabuchneri DSM20173、 Lactobacillus oligofermentans DSM15707 均 购自德国微生物菌种保藏中心。
[0034] 将已经活化的菌株单菌落分别接种于50mlMRS液体培养基中，于相应温度下培养 24h。取 Lactobacillus sunkii DSM1990410ml、Lactobacillus curvatus DSM2001940ml、 Lactobacillus parabuchneri DSM2017340ml、 Lactobacillus oligofermentans DSM1570710ml，使四种菌的最终集落形成单位数目比为1 : 4 : 4 : 1，该混合培养液中的 集落形成单位数目为1X l〇8CFU/ml。
[0035] 将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml : 5g : lg的配比混合，得到菌剂
[0036] 二、用于发酵白菜
[0037] 秋季白菜收获后，晾晒2d进行修整，清洗后层层码入陶缸，陶缸容积为750L，加入 盐，盐与鲜菜重比为1 : 100,将l〇〇ml菌剂A与水混合，倒入缸内，用腌菜石压实，发酵平均 温度为16°C，发酵时间为24d。
[0038] 在发酵的第6d，12d，18d，24d取样，测定酸菜发酵体系中乳酸菌和挥发性产物。
[0039] 菌落计数（CFUs)采用平板稀释法，乳酸菌培养采用MRS培养基，30°C培养2d计 数，所得值为三次重复平均值。
[0040] 采用HPLC测定酸菜中的挥发性产物，色谱柱为美国Bio-Rad公司Aminex87,色谱 分析有机酸条件为：5mM的硫酸作为流动相，总程序进行时间为30min，流速为0. 6mL/min， 柱温40°C，进样量为10 μ L，紫外检测器波长为205nm。重复测定三次。
[0041] 酸菜发酵18d全部腌透，质地脆嫩，呈鲜黄色。
[0042] 表1菌剂A发酵白菜24d发酵体系内乳酸菌及挥发性产物分析
[0043]
【权利要求】
1. 一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于该乳酸菌复合菌剂的活性成分 包括 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans。
2. 根据权利要求1所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于所述 乳酸菌复合菌剂中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成单位数目比为（1 ? 3) : (4 ?6) : (4 ?6) : (1 ?3)。
3. 根据权利要求2所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于所述 乳酸菌复合菌剂中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成单位数目比为1 : 4 : 4 : 1 或 1 : 2 : 2 : 1。
4. 根据权利要求1、2或3所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于 所述 Lactobacillus sunkii 为 Lactobacillus sunkii DSM19904 ;所述 Lactobacillus curvatus 为 Lactobacillus curvatus DSM20019 ；所述 Lactobacillus parabuchneri 为 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 为 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。
5. 根据权利要求1所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于所述 乳酸菌复合菌剂包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性成分、甘油和EDTA的配比为（1? 1.2)X10 nCFU : (1 ?5)g 甘油：lgEDTA。
6. 根据权利要求1所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在于所述 乳酸菌复合菌剂包括活性成分和脱脂乳粉，所述活性成分和脱脂乳粉的配比为（1? 1. 2) X 108CFU : (1 ?6) g 脱脂乳粉。
7. 根据权利要求1?6中任一所述的一种用于酸菜发酵的乳酸菌复合菌剂，其特征在 于所述乳酸菌复合菌剂在发酵白菜、圆白菜、萝卜或黄瓜中的用途。
【文档编号】C12N1/20GK104232506SQ201410341787
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】杨洪岩, 吴昊 申请人:东北林业大学, 杨洪岩