一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法

一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法。利用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术分析地震前后乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构变化，选定最具代表性的地震地区震断裂带，取样，应用酶解法提取样品总DNA，以总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将PCR产物直接利用HinfⅠ和MspⅠ限制性内切酶进行消化，酶切产物进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律，表明理化性质对地震的响应不灵敏，而细菌群落对地震的响应更为灵敏。利用细菌种群对地震具有突出的映震效果，对短临地震监测具有广泛的使用价值。
【专利说明】一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及地震预警监测【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种基于细菌群落结 构多样性的地震监测方法，进一步讲，本发明针对新疆地区为代表基于细菌群落结构多样 性的地震监测方法的【技术领域】。 【背景技术】
[0002] 新疆地震断裂带广泛分布于阿尔泰山、天山、昆仑山一带，其地震活动十分活跃。 新疆地震活动频率高、破坏性强、震源浅，是我国地震灾害极其严重的一个地区。破坏性地 震一旦发生，将会给人们的生命财产带来巨大伤害。为提高地震监测的准确性、实效性、灵 敏性和减少地震灾害带来的损害，创立一种行之有效的地震监测方法具有十分重要的意 义。
[0003] 地震孕育发生的本质是地壳内部应变能不断积累，一定条件下在断裂带处突然释 放的全过程。地下流体不仅参与这一过程，还充当着地震信息的传播媒介，因此对地震断裂 带处地下流体中水文地球化学元素的监测向来是地震监测的重要手段之一。基于这一过 程，新疆地震局多年对5级以上的强地震进行了较准确的短临预测。而水文地球化学元素 对弱震甚至是有感地震的响应并不灵敏。大多数破坏性地震的前震均为有感地震，而微生 物在地下流体中能够对环境的微小变化迅速产生反应，因而科学推测，应用细菌群落结构 多样性能够灵敏的进行地震监测将具有重要的价值和作用。
【发明内容】

[0004] 针对现有地震监测方法中未见有关利用微生物群落结构的变化监测地震的现状， 本发明旨在提供一种灵敏的、全新的、安全可靠的、地域针对性强的地震监测方法。经过实 验验证，采用本发明提供的利用的末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)技术分析地震前后 乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构变化，细菌种群对地震具有突出的映震效果，对短临地 震监测具有广泛的使用价值。
[0005] 本发明采用主要的技术方案： 利用的末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)技术分析地震前后乌鲁木齐10号泉水体 细菌群落结构变化，具体选定最具代表性的地震地区震断裂带，取样，应用酶解法提取样品 总DNA，以总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将PCR产物直接利用班/?/ I和 I限制性内切酶进行消化，酶切产物进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图谱经分析和数据 处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律，表明理化性质对地震的响 应不灵敏，而细菌群落对地震的响应更为灵敏。利用细菌种群对地震具有突出的映震效果， 对短临地震监测具有广泛的使用价值。
[0006] 本发明具体提供一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法，具体 方法步骤如下： (1)选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，将样品低温避光带回实验室，并在 短时间内将样品经微孔滤膜过滤、洗脱，置于_20°C保存备用于总DNA提取。
[0007] (2)利用的末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)技术分析地震前后采样细菌群落 结构变化：应用酶解法提取样品总DNA，以总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增， 将PCR产物直接利用限制性内切酶进行消化，酶切产物进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图 谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律，从而用于 地震的监测。
[0008] 进一步，本发明具体提供一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方 法，具体方法步骤如下： (1)选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，每隔5 d从地震断裂带的泉水中采 集泉水样品，将样品低温避光带回实验室，并在3 h内将样品用孔径为0. 22um的微孔滤膜 过滤，将滤膜放置于无菌离心管中再用GTE缓冲液进行洗脱，-20°C保存用于总DNA提取。
[0009] (2)将保存样品的离心管置于涡旋震荡仪上涡旋5-10次，使微孔滤膜上的泉水微 生物悬浮于GTE缓冲液中，取600-800uL样品应用酶解法提取样品总DNA。
[0010] (3)以上述提取的总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将上述PCR产 物直接利用Λ?/?/ I和I限制性内切酶进行消化，酶切产物送至上海生工进行T-RFLP 检测，得到T-RFLP图谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其 消长规律，从而用于地震的监测。
[〇〇11] 通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果： (1)本发明提供了一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法，基于 T-RFLP分子技术手段监测微生物的种群变化，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其 消长规律，表明理化性质对地震的响应不灵敏，而细菌群落对地震的响应更为灵敏，利用细 菌种群对地震具有突出的映震效果，对短临地震监测具有广泛的使用价值，进而应用于地 震的监测。证明了本发明提供的一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法 为地震监测提供一种灵敏、准确的新方法。
[0012] (2)本发明针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法选择乌鲁木齐10 号泉的细菌群落为代表，是基于多年来对于乌鲁木齐10号泉的监测数据，对其细菌群落组 成有所了解，即其中年动态中的优势细菌群落组成。采用本发明提供的地震监测方法，在历 次10次地震中，有9次地震前后发现泉水中出现与地震相关的部分特殊类群，而一次震中 距(震源与乌鲁木齐10号泉之间的直线距离）为1114Km的远场地震中，没有发现特殊类群 的存在，说明细菌群落用以远场地震的监测不敏感。 【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1为泉水样品总DNA图。
[0014] 图2为泉水细菌16S rRNA扩增结果图。
[0015] 图3为I和班/?/ I酶切检测结果图。
[0016] 图4为两种酶切产物的T-RFLP图谱。
[0017] 图5为采样期间水文理化性质的5日均值图。
[0018] 图6为地震前后特殊细菌类群与水文理化因子的RDA排序图。
[0019] 图7采样期间水文理化性质5日均值变化图。
[0020] 图8地震前后新出现的泉水细菌类群与水文理化因子的CCA分析结果图。 【具体实施方式】
[0021] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0022] 本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备： 样品的采集源：选择的乌鲁木齐10号泉位于乌鲁木齐南部柳树沟-红雁池断裂带（E 87° 37 7，N 43° 42 7 )，海拔1042 m。该泉水量丰富（水流量为2. 07 L/ s)，水温年变 化甚微，常年维持在12°C左右，pH值大于7,属于弱碱性矿化水。泉水来源于博格达山区的 大气降水与高山积雪融水补给。由于其补给区较远，渗流路径较长，循环于地下深处，很少 受到外部气象和人为因素的影响，从而使泉水能更多的携带来自地球内部的多种信息，是 中国新疆与哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦两国交换地下流体资料的监测泉点之一，同时也是 探索地下水细菌群落响应地震的优质样地。根据泉中微生物种群变化、水质、气体、氡、汞等 测项，较为准确地对新疆乌苏、沙湾、石河子、和静、和硕等6次5级以上地震进行了短临预 测。新10泉是乌鲁木齐目前最好的，也是监测项目最全的，是国际交换与共享台站，是国际 交换国家最多，映震最为灵敏，是最具能代表新疆地区的地震发生情况和规律，以新10泉 为代表的新疆地震情况如何将细菌群落结构多样性用于地震监测具有重要的现实意义。
[0023] 本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知 的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0024] 实施例一：基于细菌群落结构变化的地震监测方法 一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法具体步骤如下： (1)选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，将样品低温避光带回实验室，并在 短时间内将样品经微孔滤膜过滤、洗脱，置于-20°c保存备用于总DNA提取。
[0025] (2)利用的末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)技术分析地震前后采样细菌群落 结构变化：应用酶解法提取样品总DNA，以总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增， 将PCR产物直接利用限制性内切酶进行消化，酶切产物进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图 谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律。
[0026] 实施例二：基于细菌群落结构变化的地震监测方法 一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法具体步骤如下： (1)选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，每隔5 d从地震断裂带的泉水中采 集泉水样品，将样品低温避光带回实验室，并在3 h内将样品用孔径为0. 22um的微孔滤膜 过滤，将滤膜放置于无菌离心管中再用GTE缓冲液进行洗脱，-20°C保存用于总DNA提取。
[0027] (2)将保存样品的离心管置于涡旋震荡仪上涡旋5-10次，使微孔滤膜上的泉水微 生物悬浮于GTE缓冲液中，取600-800uL样品应用酶解法提取样品总DNA。
[0028] (3)以上述提取的总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将上述PCR产 物直接利用/和/限制性内切酶进行消化，酶切产物送至上海生工进行T-RFLP 检测，得到T-RFLP图谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其 消长规律。
[0029] 实施例三：基于细菌群落结构变化的地震监测方法 从2011年9月1日至2012年7月2日，每日测定断裂带处乌鲁木齐10号泉水体12项 理化指标，分别为氩、氡、氮、硫化物、甲烷、二氧化碳、氦、氟、水汞、流量、气体总量、电导率。
[0030] 在此期间每隔5 d采集地震断裂带泉水样品3 L，样品低温避光带回实验室。并在 3 h内将样品用孔径为0. 22um的微孔滤膜过滤，将滤膜放置于无菌离心管中，再用lOmLGTE 缓冲液进行洗脱，_20°C保存用于总DNA提取。
[0031] 将样品保存的离心管置于涡旋震荡仪上涡旋5-10次，使微孔滤膜上的泉水微生 物悬浮于GTE缓冲液中。取800 μ L GTE洗脱液至2mLEP管中，加入溶菌酶（10 mg /mL) 30 yL至终浓度为10mg /mL，37°C水浴2 h，每隔15-20min颠倒混匀数次；加入蛋白酶K(20 mg /mL)10 yL 至终浓度为 0· 2 mg /mL，20% 的 SDS 17 yL和 5 mol /L 的 NaCl 10 yL， 53°C水浴2 h，每隔15-20min颠倒混合数次；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1， V Λ)进行抽提，lOOOr/min离心；将上清转移至新的EP管中，再加入2 /3体积的氯仿抽 提，lOOOr/min离心；将上清转移至新的EP管中，加入0. 6倍的异丙醇，置4°C过夜沉降； 次日，12000r/min离心20min，弃上清，用预冷的70%乙醇(现配现用）清洗1次，风干；力口 入20 yL TE缓冲液，-20°C保存。
[0032] 以上述提取的总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增， 正向引物为 8F(5' -FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')， 反向引物为 926R(5' -CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3')。
[0033] PCR 反应体系为 30uL :Premix 15uL，正反引物各 0· 25uL，DNA 模板 0· 5 uL，Taq 酶 0. 05uL，ddH2014uL。扩增程序采用降落式PCR :预变性94°C 6min，前10个循环为94°C 45s、61°C 45s、72°C 90s、(每个循环递减 0.5°C)，后 20 个循环为 94°C 45s、56°C 45s、72°C 90s，72°C再延伸7min。扩增产物利用1 %的琼脂糖凝胶，DNA Marker II电泳检测。
[0034] 将上述PCR产物直接利用班/?/ /和/限制性内切酶进行消化，酶切条件为 37°C水浴酶切10h左右后，利用2. 5%的琼脂糖凝胶，lOObp Marker电泳检测，随即65°C水 浴终止反应15min。酶切产物送至上海生工进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图谱。经Mica 数据库比对和分析后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律。
[0035] 上述实施例方法提取样品总DAN、细菌PCR产物检测参见附图1和附图2。双酶切 样品检测参见附图3,酶切片段大小均小于PCR产物，表明酶切条件可行。附图4为双酶切 的T-RFLP图谱。
[0036] 由新疆地震局网可得表1，其信息为采样期内发生的10次地震资料。由采样期内 泉水理化性质如附图5,可知，在地震前后水体各个监测值均未发生显著异常。经数据库对 t匕，如果同一菌群在两种酶切数据中均存在，则可确定该菌群存在于泉水样品中，表2为泉 水样品普遍存在的优势类群；表3为地震前后新出现的特殊类群所占的比例，在没发生地 震的时期内均未发现有特殊类群的存在。
[0037] 表1: 2011年9月1日至2012年7月2日地震详情表
【权利要求】
1. 一种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法，其特征在于，所述的基 于细菌群落结构变化的地震监测方法具体步骤如下： (1) 选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，将样品低温避光带回实验室，并在 短时间内将样品经微孔滤膜过滤、洗脱，置于-20°c保存备用于总DNA提取； (2) 利用的末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)技术分析地震前后采样细菌群落结 构变化：应用酶解法提取样品总DNA，以总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将 PCR产物直接利用限制性内切酶进行消化，酶切产物进行T-RFLP检测，得到T-RFLP图谱经 分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消长规律，从而用于地震 的监测。
2. -种针对新疆地区基于细菌群落结构变化的地震监测方法，其特征在于，所述的基 于细菌群落结构变化的地震监测方法具体步骤如下： (1) 选中代表性的地震断裂带的泉水作为采样对象，每隔5 d从地震断裂带的泉水中采 集泉水样品，将样品低温避光带回实验室，并在3 h内将样品用孔径为0. 22um的微孔滤膜 过滤，将滤膜放置于无菌离心管中再用GTE缓冲液进行洗脱，-20°C保存用于总DNA提取； (2) 将保存样品的离心管置于涡旋震荡仪上涡旋5-10次，使微孔滤膜上的泉水微生物 悬浮于GTE缓冲液中，取600-800uL样品应用酶解法提取样品总DNA ; (3) 以上述提取的总DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将上述PCR产物直 接利用Hinf I和Msp I限制性内切酶进行消化，酶切产物送至上海生工进行T-RFLP检 测，得到T-RFLP图谱经分析和数据处理后，获得泉水土著及地震前后细菌群落组成和其消 长规律，从而用于地震的监测。
【文档编号】C12Q1/04GK104109717SQ201410341243
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】罗娇, 张涛, 林青, 高小其, 娄恺 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所