专利名称：Dgge技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法
技术领域：
本发明涉及海洋浮游植物种类和/或数量检测的技术领域，特别涉及DGGE技术在 检测浮游植物群落结构中的使用方法。
背景技术：
浮游生物是一个在水体中营随波逐流生活方式的独特类群，易于在风和水流的作 用下做被动运动，没有或仅有微弱的游动能力；浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。 浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的 变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反 之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均勻的情况。因此浮游生物群落结构特征的变 化可作为指示生态环境变化的重要生物学参数。赤潮浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件 下爆发性增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。在我国海域中，赤潮发 生的区域分布很不均勻，浙江沿海及长江口临近海域的赤潮灾害最为严重，此外发生赤潮 比较集中的海区还有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域发生一次 特大面积米氏凯伦藻赤潮，所影响到的海区养殖鱼类几乎全部死亡，造成了珠江口海域三 地(深圳、珠海和香港)水产养殖业损失逾4亿元之多；2000年长江口海域发生大面积具 齿原甲藻赤潮，危害面积达7000平方千米，2004年5月东海长江口海域发生大规模东海原 甲藻赤潮，面积达10000平方千米，世界罕见。近年来，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆发 越来越频繁，且涉及的范围也越发广泛。赤潮严重破坏了海洋生态平衡，给渔业及旅游业等 造成了巨大的损失。除此之外，有些赤潮生物体内或代谢产物中含有生物毒素，通过食物链 富集，会严重危害人类的健康。在海洋浮游植物种类和/或数量检测的技术领域，变性梯度凝胶电泳技术(DGGE) 以其显著的优点得到了广泛的应用。DGGE技术不仅结果可靠、重现性好、操作简便快速，而 且可以同时对大量的样品进行分析，并能对微生物的时空变化进行检测，已经成为研究微 生物生态的一种重要技术。此外，充分了解该技术的局限性并综合使用PCR-DGGE技术与其 它生物学技术，可以更加详尽地了解微生物群落的结构及动态变化，获得全面可靠的生物 学fe息。近年来DGGE之所以得到了如此广泛的应用，是由于它具有其它分子多态性技术 不能比拟的优点第一，操作简便、快速，加样量小，重复性好；第二，可以对大量的样品同 时进行分析，通过对回收的DNA条带进行测序确定群落的组成；第三，可以用于研究微生物 群落的时空分布；第四，可以确定复杂的样品中的特定的DNA序列。但是，同时该技术也存 在缺陷(1)仅能检测到环境中的主要微生物，占总量以上的微生物才可以被检测到；
(2)DGGE可分离的片段大小位于200-700bp之间，大于700bp的片段不能进行很好的分离；
(3)不同序列的DNA有可能迁移到胶的同一位置，有时即使对条带进行回收，重新扩增，重 新电泳也不能得到很好的分离；(4)有些物种基因的不同拷贝之间存在异质性问题，即使它们仅有微小的差异，DGGE也能将其分开，因此一个种在DGGE图谱上不仅显示一条带，这 样就过高地估计了环境中的微生物多样性；(5)此外整个分析过程的各个步骤本身都存在 一定的局限性样品的收集及保存过程中，可能会损失部分微生物种类；由于不同物种的 细胞壁组成不同，相同的提取方法对不同物种的提取效率不同；PCR本身存在扩增的偏好 性问题，并且扩增过程中可能产生嵌合体及异源双链，这些对实验结果均有一定影响。鉴于上述所述，研究浮游植物赤潮的爆发机制，探索预警、预报乃至防治赤潮的方 法已成为一个极具挑战性的课题，其中在检测浮游植物群落结构的过程中，DGGE技术在检 测浮游植物群落结构中的使用方法，对浮游植物群落结构的检测结果，具有重要影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻 的鉴定中，并运用该技术对浮游植物多样性进行研究，分析多样性组成与环境因子的关系。为了实现上述目的，本发明提供了一种DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的 使用方法，其中，包括以下步骤将浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μπι孔径 的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2ml Eppendorf管中，置于-20°C，用于浮游植物群落 多样性的分析；收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750 μ 1 TE缓冲液洗涤藻细胞， IOOOOrpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；加入250 μ 1 TE缓冲液悬浮藻细胞；裂解藻细胞加入500 μ 1预热55°C的抽提缓冲液，混和均勻，放入55°C水浴中一 小时，直到藻液呈透明状；放进4°C冰箱冷却3分钟；抽提加入Iml氯仿异戊醇(24 1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；HOOOrpm 4°C 离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600 μ 1)至印pendorf管中，重复抽提一次；沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分钟；14000rpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；洗涤DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次；溶解自然风干，溶于20-40 μ 1 TE缓冲液中，置于_20°C待用。进一步包括从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序列；运 用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最 优引物进行合成的步骤。进一步包括PCR及琼脂糖电泳检测的步骤具体如下PCR进行扩增所使用的引 物为FP-5’ CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’， RP-5’ ACGGGCGGTGTGTRC3’，所述PCR扩增所用引物或者为F1427-5 ’ CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTT CTGGG3，，R1616-5，GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3，，
所述PCR的反应体系(50ul)包括
模板DNA，
200 μ M dNTP,
1. 5mM MgCl2,
0· 3μΜ引物，
2.5U Ex Taq DNA polymerase,
1 XEx Taq Buffer。
所述PCR的反应程序为
94°C，变性 2min ；
72°C，延伸 7min;PCR反应程序或者为94°C，变性 5min; 72°C延伸 IOmin。所述琼脂糖电泳检测为将5 μ 1扩增的产物与Iul上样缓冲液混合后上样，1 % 琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0. 5 μ g/ml EB的1 XTAE缓冲液中染色10 30min，用凝胶成像系统进行拍照。进一步包括以下步骤采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反 应产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，所述电泳条件为PCR产物分析采用8%的聚丙 烯酰胺凝胶，变性剂浓度从35%到50% (100%的变性剂为7M的尿素和40%的去离子甲酰 胺的混合物)，150V，1XTAE缓冲液中电泳6h;或者，PCR产物分析采用10%的聚丙烯酰胺 凝胶，变性剂浓度从30 %到55 %，150V, 1 X TAE缓冲液中电泳8h ；电泳完毕后，将凝胶置于 0. 5 μ g/ml EB溶液中震荡染色20min，凝胶成像系统拍照。进一步包括以下步骤使用Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱， 采用非加权配对算数平均法聚类分析对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性 指数(H)，进而对物种结构多样性进行分析；所述多样性指数的计算公式为H =Σ (ni/N)ln(ni/N)，其中ni为每条带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。进一步包括以下步骤利用软件Canocc^version 4.51)进行典范对应分析 (Canonical correspondence analysis, CCA分析)，分析DGGE所揭示的物种多样性和环 MS^^^kM (Ter Braak, 1986), M automated forwardseIection method ^ variance inflation factor (VIF)大于 20 的环境因子，利用 Monte Carlo permutation test (499 permutations)用来选择与物种组成显著相关的环境变量。PCR扩增产物的琼脂糖电泳，各个样品的扩增均得到大小为260bp左右的单一特 异性扩增片段，同时阴性对照没有DNA条带出现，正向引物的5’端增加了一个40bp的GC 夹，用于保证DNA分子始终保持双链结构，使扩增片段大小介于200-700bp之间。本发明的优点如下本发明将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻的鉴定中，并运用该技术对 浮游植物多样性进行了研究，分析了多样性组成与环境因子的关系。主要如下(1)本发明分别针对核糖体基因的18S rDNA、28S rDNA及ITS区序列设计引物，经 过PCR退火温度的优化，选择了特异性较好的三对引物(分别针对18S rDNA和28S rDNA 序列)，对微藻进行了 DGGE分析，获得了每种藻每对弓I物的扩增片段在变性梯度凝胶上的 迁移率。(2)本发明在变性梯度凝胶上的迁移率，可以较好地将其区分鉴定；而将其中的 两对或三对引物相结合，可以得到更为满意的区分效果。(3)基于DGGE图谱的聚类分析结果与环境特征较为一致；证明温度是影响研究海 域浮游植物分布的主要因子，其次是溶解无机氮和硅酸盐。(4)运用DGGE技术浮游植物多样性研究，了解营养盐、温度等环境因子对浮游植 物群落组成的影响。基于DGGE图谱的相似性进行聚类分析。
图1为PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。图2为各样品的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施例方式本发明提供了一种DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其中，包括 以下步骤将浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μπι孔径 的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2ml Eppendorf管中，置于-20°C，用于浮游植物群落 多样性的分析；收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750 μ 1 TE缓冲液洗涤藻细胞， IOOOOrpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；加入250 μ 1 TE缓冲液悬浮藻细胞；裂解藻细胞加入500 μ 1预热55°C的抽提缓冲液，混和均勻，放入55°C水浴中一 小时，直到藻液呈透明状；放进4°C冰箱冷却3分钟；抽提加入Iml氯仿异戊醇(24 1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；HOOOrpm 4°C 离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600 μ 1)至印pendorf管中，重复抽提一次；
沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分钟；14000rpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；洗涤DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次；溶解自然风干，溶于20-40 ill TE缓冲液中，置于-20°C待用。从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序列；运用DNAStar 软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5. 0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最优引物进 行合成的步骤。PCR及琼脂糖电泳检测的步骤具体如下PCR进行扩增所使用的引物为 FP-5’ CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’, RP-5’ ACGGGCGGTGTGTRC3’，PCR扩增所用引物或者为F1427-5 ’ CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTT CTGGG3，，R1616-5 ’ GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3 ’，PCR的反应体系(50ul)包括模板 DNA,200 uM dNTP,1. 5mM MgC12,0.3iiM 引物，2.5U Ex Taq DNA polymerase,IXEx Taq Buffer。PCR的反应程序为94°C，变性 2min; 72°C，延伸 7min;PCR反应程序或者为94°C，变性 5min;94°C,变性 30S，
52°C,退火lmin, I 30个循环；
72°C,延伸 1.5min,〉72°C延伸 lOmin。琼脂糖电泳检测为将5 yl扩增的产物与lul上样缓冲液混合后上样，琼脂糖 凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0. 5 y g/ml EB的1XTAE缓冲液中染色10 30min， 用凝胶成像系统进行拍照。采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行变性梯度凝 胶电泳(DGGE)分析，所述电泳条件为PCR产物分析采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓 度从35%到50% (100%的变性剂为7M的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物)，150V， 1XTAE缓冲液中电泳6h ；或者，PCR产物分析采用10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从 30%到55%，150V，1XTAE缓冲液中电泳8h ；电泳完毕后，将凝胶置于0. 5 y g/ml EB溶液 中震荡染色20min，凝胶成像系统拍照。使用Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱，采用非加权配对算数平 均法聚类分析对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性指数(H)，进而对物种结 构多样性进行分析；所述多样性指数的计算公式为H = E (ni/N) ln(ni/N)，其中ni为每条 带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。禾lj用软件 Canoco (version 4. 51)进行典范对应分析(Canonicalcorrespondence analysis, CCA分析)，分析DGGE所揭示的物种多样性和环境因子的关系(Ter Braak, 1986),用 automated forward selection method 去除 variance inflation factor (VIF)
20 Wif, ^Jffi Monte Carlopermutation test (499 permutations)
物种组成显著相关的环境变量。PCR扩增产物的琼脂糖电泳，各个样品的扩增均得到大小为260bp左右的单一特 异性扩增片段，同时阴性对照没有DNA条带出现，正向引物的5’端增加了一个40bp的GC 夹，用于保证DNA分子始终保持双链结构，使扩增片段大小介于200-700bp之间。例子以所提取的各个站位样品的基因组DNA为模板，对18S rDNA的部分片段进行扩 增，PCR扩增产物的琼脂糖电泳图如图1所示。各个样品的扩增都具有很好的特异性，均得 到大小为260bp左右的单一特异性扩增片段，同时阴性对照没有DNA条带出现。由于在正 向引物的5’端增加了一个40bp的GC夹，既可以保证DNA分子始终保持双链结构，又提高 了扩增片段用于DGGE分析的分离效果，并且扩增片段大小介于200-700bp之间，适合用于 DGGE分析。图 1 中的各数据如下F0301，2. F0303，3. F0305，4. F0307，5. F0308，6. F0309， 7.F0311,8.F0401,9.F0402,10.F0404,11. F0406,12. F0501,13. F0502,14. F0503,
15.F0504, M, DL2000.图2为各样品的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中各数据如下
16.F0506,17.F0508,18.F0510,19.F0512,20.F0701,21.F0702,22.F0704,23.F0706, 24. F0708, 25.阴性对照，M, DL2000.
10
DGGE指纹图谱中，每个独立分离的条带称为一个可操作分类单元，可能包括一种 或一种以上的浮游植物。DGGE指纹图谱呈现的条带越丰富说明群落多样性越大，条带越亮， 表示该0TU的数量越多，因此可以根据指纹信息确定不同样品中所含有的浮游植物OUT的 数量关系，得出浮游植物多样性的信息。从各站位的条带数在采样站位图上的分布(如下 表)可以看出，条带数在各站位间的变化趋势并不明显。 本例子中所用引物为真核生物通用引物，因此，在PCR扩增产物中基本上不包含 浮游细菌。采集样品时，首先采用200目的筛绢进行过滤，主要浮游动物得到了很好的去 除；即使有少量体积较小的浮游动物能通过筛绢，但在进行PCR的过程中，由于存在模板的 竞争，在群落组成中占绝对优势的浮游植物会被优先扩增。因此，本发明的主要研究对象为 浮游植物。一般说来，DGGE图谱中主要条带相对含量和群落中主要类群之间呈现出一定的正 相关关系，通过DGGE技术获取的群落主要类群组成信息可以较为真实地反映群落的遗传 组成。DGGE指纹图谱呈现的条带越丰富说明群落多样性越大，因此可以根据指纹信息得出 浮游植物多样性的信息。从本发明所揭示的各站位的条带数及香农指数来看，大部分站位 具有较高的浮游植物组成，且多样性指数比较均勻。具有相似浮游植物组成的站位将会呈 现相似的DGGE图谱，聚类分析时首先会聚在一起成为一支。本 发明用非加权配对算数平均 法UPGMA聚类方法比较了各样品中浮游植物群落的相似性。
权利要求
一种DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在于，包括以下步骤将浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2ml Eppendorf管中，置于 20℃，用于浮游植物群落多样性的分析；收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750μl TE缓冲液洗涤藻细胞，10000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；加入250μl TE缓冲液悬浮藻细胞；裂解藻细胞加入500μl预热55℃的抽提缓冲液，混和均匀，放入55℃水浴中一小时，直到藻液呈透明状；放进4℃冰箱冷却3分钟；抽提加入1ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4℃离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600μl)至eppendorf管中，重复抽提一次；沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混匀，放入 80℃冰箱30分钟；14000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；洗涤DNA沉淀用预冷的70％酒精洗两次；溶解自然风干，溶于20 40μl TE缓冲液中，置于 20℃待用。
2.根据权利要求1所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，进一步包括从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序列；运用 DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最 优引物进行合成的步骤。
3.根据权利要求1所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，进一步包括PCR及琼脂糖电泳检测的步骤具体如下PCR进行扩增所使用的引物为FP-5 ’ CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’ , RP-5’ ACGGGCGGTGTGTRC3’，所述PCR扩增所用引物或者为F1427-5， CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG3，，R1616-5’ GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3’，
4.根据权利要求3所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在于， 所述PCR的反应体系(50ul)包括 模板DNA， 200 μ M dNTP,1.5mM MgCl2, 0· 3μΜ引物，2.5U Ex Taq DNA polymerase, 1 XEx Taq Buffer。
5.根据权利要求3或4所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征 在于，所述PCR的反应程序为 94°C，变性 2min ；
6.根据权利要求3所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，所述琼脂糖电泳检测为将5μ 1扩增的产物与Iul上样缓冲液混合后上样，琼脂糖 凝胶电泳，IOOV恒压电泳30min，在含0. 5 μ g/ml EB的1 XTAE缓冲液中染色10 30min， 用凝胶成像系统进行拍照。
7.根据权利要求1所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，进一步包括以下步骤采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物 进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，所述电泳条件为PCR产物分析采用8%的聚丙烯酰胺 凝胶，变性剂浓度从35%到50% (100%的变性剂为7M的尿素和40%的去离子甲酰胺的混 合物)，150V，lXTAE缓冲液中电泳6h ；或者，PCR产物分析采用10%的聚丙烯酰胺凝胶，变 性剂浓度从30%到55%，150V, IXTAE缓冲液中电泳8h ；电泳完毕后，将凝胶置于0. 5 μ g/ ml EB溶液中震荡染色20min，凝胶成像系统拍照。
8.根据权利要求1所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，进一步包括以下步骤使用Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱，采用 非加权配对算数平均法聚类分析对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性指数 (H)，进而对物种结构多样性进行分析；所述多样性指数的计算公式为H = Σ (ni/N) In (ni/ N)，其中ni为每条带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。
9.根据权利要求1所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，进一步包括以下步骤利用软件Canoco (version 4. 51)进行典范对应分析(Canonical correspondence analysis, CCA分析)，分析DGGE所揭示的物种多样性和环境因子 ^] ^ M (Ter Braak, 1986)，M automated forward selection method ^ P余 variance inflation factor (VIF)大于 20 的环境因子，利用 Monte Carlo permutation test (499 permutations)用来选择与物种组成显著相关的环境变量。
10.根据权利要求6所述DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其特征在 于，PCR扩增产物的琼脂糖电泳，各个样品的扩增均得到大小为260bp左右的单一特异性扩增片段，同时阴性对照没有DNA条带出现，正向引物的5’端增加了一个40bp的GC夹，用于 保证DNA分子始终保持双链结构，使扩增片段大小介于200-700bp之间。
全文摘要
本发明公开了一种DGGE技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法，其中，包括以下步骤将浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2mlEppendorf管中，置于-20℃，用于浮游植物群落多样性的分析；收集和洗涤藻细胞进行DNA的提取，进行PCR及琼脂糖电泳检测，使用DGGE进行浮游植物群落结构分析，最后进行图形处理和数据分析。本发明可精确检测浮游植物群落的结构组成，有利于浮游植物赤潮的爆发预警。
文档编号C12Q1/04GK101892310SQ201010184810
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者于志刚, 孙静, 甄毓, 米铁柱 申请人:中国海洋大学