一种赤潮藻种快速鉴定的方法

专利名称：：一种赤潮藻种快速鉴定的方法
技术领域：
：本发明涉及海洋浮游植物种类和/或数量检测的
技术领域：
，特别涉及一种赤潮藻种快速鉴定的方法。
背景技术：
：在富饶的海洋世界里，有着许许多多的海洋生物，除了有形式各样的海洋鱼类等海洋动物，还有着为海洋提供基础生产力的海洋植物。它们分布于海洋的各个层面，而作为海洋植物主要组成部分的海洋藻类，是人类的一大宝贵的自然财富，它们可以作为食物，也可以做成保健药品。人们根据海洋藻类的不同的生活习惯，把它们分为底栖藻和浮游藻两大类型。浮游藻藻体仅由一个细胞组成，又称为单细胞藻类，是一类具有色素或色素体能进行光合作用，并制造有机物的自养型单细胞浮游生物。它们是海洋中最重要的初级生产者，也是海洋生态系统中食物链中最基础的一环。浮游藻能漂浮或悬浮在有光的水面上做极其微弱的浮动，与其适应漂浮生活的各种体型是分不开的。有的浮游藻为了增大与水面接触的表面积，其细胞周围生出一圈刺毛、长长的刺或突起物，还有的成群结队的积在一块，以扩大表面积来利于漂浮。浮游藻植物形状各有特色，有纺锤形、扇形、星形等。它们多数是单细胞的，也有许多是由单细胞结合起来的群体。绝大多数浮游植物的个体都非常微小，只有几个至几百微米，只能在显微镜下才能看清楚其形态结构，但其数量极多，代谢活动强烈。虽然浮游藻形体微小，运动能力较弱，但它的存在对整个地球生态系统来说是极其重要的。首先，浮游藻处于有光的水体表面，它们在水面进行光合作用，固定无机碳，使之转化为碳水化合物。据估计，全球约50%的初级生物力源于海洋，而海洋浮游植物又是海洋初级生产力的最主要来源，仅硅藻一类就贡献了海洋初级生产力的60%。其次，浮游藻类是为地球提供化合氮的重要生物，如蓝藻。最后，海洋浮游植物位于海洋食物链的最底层，它们是小型海洋动物，尤其是海洋动物幼体的直接或间接饵料。某个海域浮游植物的生物量和多样性直接影响该区域其它高级动物的多样性和分布。赤潮是海水中某些单细胞藻类，原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。一般称藻类大量繁殖的现象为藻华，赤潮也被称为有害藻华。赤潮是一种自然生态现象，也是一种人为因素引起的有害生态现象。赤潮一般可分为有毒赤潮与无毒赤潮两类。有毒赤潮是指赤潮生物体内含有某种毒素或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可对赤潮区的生态系统、海洋渔业、海洋环境、以及人体健康造成不同程度的损害。无毒赤潮是指生物体内不含毒素，又不分泌毒素的生物体为主形成的赤潮。无毒赤潮对海洋生态、海洋环境、海洋渔业也会产生不同程度的损害。除了根据毒素的有无对赤潮进行划分外，赤潮还可以根据不同的标准有以下不同的分类方法。首先，根据赤潮爆发的地点，可分为外海性赤潮和近岸、内湾性赤潮。由于大洋上升流区或水团交汇处营养物质比较丰富，容易爆发外海性赤潮。在中国主要分布于东海以南水域。近岸、内湾、河口性赤潮，指发生于近岸区、内湾区或河口区等水城的赤潮。其次，根据赤潮的来源可分为外来型和原发型赤潮。所谓外来型赤潮，是指不是在原海域形成的赤潮，而是在其他水域形成后，由于风、浪、流等外力作用被带到该海域的。其特点表现在持续时间比较短，有时候会把同一起赤潮的迁移误认为两起发生在不同地方的赤潮。原发性赤潮是指原海域自身发生的赤潮，其特点是持续时间较长，而且会反复出现。一般而言在内湾发生的赤潮大多是属于原发性赤潮。最后，根据引发的赤潮的生物种类的多少，可分为单相型、双相型和复合型赤潮。单相型赤潮是指赤潮爆发时，只有一个赤潮生物种占绝对优势。同理，双相型即指两种赤潮生物共存并同时占优势而形成的赤潮。复合型赤潮由三种以及三种以上赤潮生物所引起，且每种的数量都占有总数的20%以上。赤潮的危害主要表现在首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水体酸碱度发生较大变化，从而影响海洋生物的群落结构；在赤潮发生过程中，由于大量赤潮生物的疯长，阻挡了阳光到达水体的深度，降低了水体的透明度，导致生长于水体深层的水草和海洋动物大量死亡，底层生物量锐减。其次，在赤潮生物疯长过程中，不但竞争性消耗水中的营养物质，而且分泌一些抑制其他生物生长的物质，如赤潮藻毒素。结果导致水体中赤潮生物占绝对优势，而其他生物种类减少，严重破坏水体的生物多样性。再次，赤潮生物的缺氧或造成水体累积大量硫化氢和甲烷，隔绝了海水与大气圈的气体交换，使很多海洋生物窒息或者中毒而死。最后，一些赤潮生物(如某些甲藻)产生的粘液附着在海洋动物的鳃上，妨碍呼吸作用，使大型水生动物窒息而死，给近海养殖业造成巨大损失。许多赤潮生物含有毒素，该毒素可使海洋动物因赤潮生物毒素的积累和食物链传递作用而中毒死亡或生长繁殖受到影响。赤潮对人体健康的影响也很大，直接接触会引起皮肤的不适，而一些挥发性毒素还可能能对眼睛和呼吸道产生影响，更主要的是由于食物链的传递作用，有害赤潮产生的赤潮生物毒素会导致人类的中毒甚至死亡。所以，研究建立赤潮的预警机制是必要的，而赤潮的预警需要了解其结构的多样性，则必须建立赤潮藻RELP的特征性图谱，在建立过程中的PCR扩增及条件优化等，对快速鉴定赤潮藻种有重要影响。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于，本发明运用限制性片断长度多态性技术(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)Wtl^ii^PCR-RFLP,l^jM^ilM种的特征酶切图谱，在此基础上，发明了赤潮藻种的快速鉴定方法。为解决上述技术问题，本发明提供了一种赤潮藻种快速鉴定的方法，其中，包括以下步骤a、实验藻种m及其衍生培养基的配制b、引物设计与验证C、实验藻种18SrDNA片段的获得d、PCR优化及扩增e、模拟酶切和实际酶切对照实验f、RFLP区分鉴别赤潮藻种。所述步骤a为f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高温灭菌。；f/2维生素溶液向950mL蒸馏水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的储存液，定容至1L，过滤灭菌，置于4°C；f/2培养基向950mL蒸溜水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20，Na2Si03·9Η20，，并定溶至1L，高温灭菌，储存于4°C备用；f/2-Si培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，配方同f/2培养基，不加Na2Si03·9H20；f/50培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，冷却至室温后中添加40μ1营养元素，40μ1微量元素溶液，20μ1维生素溶液，补充过滤新鲜海水至1L。所述步骤b为(1)实验藻种目标序列(18SrDNA)信息的获得和比对基于NCBI中的GenBankDNA序列数据库的相关信息，获取实验藻种的18SrDNA序列的相关信息，并运用DNAstar软件对序列信息进行对比，以搜寻合适的设计引物的区域；(2)实验藻种目标序列(18SrDNA)对比和引物的设计根据DNAstar软件序列对比的结果，通过PrimerPremier-v软件对引物相关条件的设置，设计出最优引物。所述步骤c为(1)实验藻种基因组DNA的提取与纯化(2)PCR反应(3)PCR的优化选取18SrDNA序列，设计出引物1、引物2、引物3，其序列为引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步骤d为(1)PCR反应中Mg2+的浓度的优化(2)PCR反应中模板起始浓度的优化(3)PCR反应中引物起始浓度的优化然后进行PCR扩增。所述步骤e为将实验藻种序列信息录入excel软件，并结合实验用到的限制性内切酶的酶切信息，通过excel软件，作出酶切片段数和长度的信息，建立初级酶切信息数据表；根据模拟数据表建立的信息，进行筛选，从中挑选出限制性内切酶，运用VectorNTISuite9软件确定凝胶电泳的条件，然后对实验藻种序列进行模拟的酶切，并跑出模拟电泳图，根据此初步判断其区分鉴别程度；选取部分实验藻种进行酶切实验，并与的模拟实验结果进行比对，验证模拟实验和实际试验的吻合程度，其中，反应体系为总体积30μ1，其中18SrDNA扩增产物15μ1，酶切反应缓冲液5μ1，内切酶3μ1，灭菌重蒸水7μ1；反应时间为65°C条件下90min，其酶切产物也用凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1%，电压100V，电泳30min，然后在凝胶成像系统中进行分析。所述步骤e进一步包括如下步骤选取实验藻种对选择的限制性内切酶进行实验，作出酶切电泳图，作出单个的藻种酶切图谱，用于鉴别和区分，并对相关酶切实验条件进行优化；对照模拟实验结果和实际实验结果，构建赤潮藻种的RFLP图库，并在此基础上建立标准化的基于RELP技术的赤潮藻种分类鉴定方法，对试验藻进行了五次的重复实验，并计算条带大小；收集实验藻种18SrDNA序列信息，并综合主要限制性内切酶的信息，结合数据库和VectorNTISuite9软件，选取用酶，作出模拟电泳图，优选为TaqI酶作为实验用酶；计算模拟实验和实际实验的对比结果，计算实际实验的条带数和条带大小的位置是否与拟实验结果基本一致。所述步骤e进一步包括如下步骤(1)酶切样品量的优化取三个酶切对象的量进行优化，分别是5μ1、10μ1、15μ1，然后进行电泳分析；(2)酶切时间的优化取5个时间段对本实验进行优化，分别是90min、120min、150min、180min、210min然后进行电泳分析；(3)酶切用酶量的优化取三个酶的用量对本实验进行优化，分别是2μ1、3μ1、4μ1;然后进行电泳分析，对各验藻种进行了RFLP酶切实验，在酶切之后固定凝胶浓度以及电泳的电压、电泳时间因素，并作出其酶切图谱，用于鉴别和区分藻种。所述步骤f为对未知藻种进行培养，提取DNA，对藻种进行扩增，得到目的片段后对目的片段进行酶切，酶切后进行电泳，得到电泳图谱后对电泳图谱进行分析，对电泳图谱的分析，应根据电泳图谱中酶切样品的片段数以及片段和marker的相对位置来确定，其中，条带片段大小估算公式L=(WXC)+DL为条带分子量W目标条带所处的两条marker之间的比例位置C为条带所处的两条marker片段差值D两条marker条带中较小的一条的分子量误差为士C/10，(C为marker两条带之差值)。所述赤潮藻种快速鉴定的方法在检测浮游生物群落结构中的应用本发明的优点在于，RFLP作为一种分子多态性的实验手段，其主要功能在于对生物物种的差性的区分，作为一种用于鉴定的赤潮藻种的分子生态学手段，可以作为传统鉴定方法的补充和辅助手段。而本发明，基于FELP建立特征性图谱，将整个流程标准化，将有利于对赤潮藻种进行快速简捷的初步鉴定。图1整体模拟酶切电泳结果图。图2为酶切样品量的优化。图3酶切用酶量优化。图4酶切时间的优化实验。图5为判断结果示意图具体实施例方式本发明提供了一种赤潮藻种快速鉴定的方法，其中，包括以下步骤a、实验藻种m及其衍生培养基的配制b、引物设计与验证C、实验藻种18SrDNA片段的获得d、PCR优化及扩增e、模拟酶切和实际酶切对照实验f、RFLP区分鉴别赤潮藻种。所述步骤a为f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高温灭菌。；f/2维生素溶液向950mL蒸馏水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的储存液，定容至1L，过滤灭菌，置于4°C；f/2培养基向950mL蒸馏水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20,Na2Si03·9H20,，并定溶至1L，高温灭菌，储存于4°C备用；f/2-Si培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，配方同f/2培养基，不加Na2Si03·9H20；f/50培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，冷却至室温后中添加40μ1营养元素，40μ1微量元素溶液，20μ1维生素溶液，补充过滤新鲜海水至1L。所述步骤b为(1)实验藻种目标序列(18SrDNA)信息的获得和比对基于NCBI中的GenBankDNA序列数据库的相关信息，获取实验藻种的18SrDNA序列的相关信息，并运用DNAstar软件对序列信息进行对比，以搜寻合适的设计引物的区域；(2)实验藻种目标序列(18SrDNA)对比和引物的设计根据DNAstar软件序列对比的结果，通过PrimerPremier-v软件对引物相关条件的设置，设计出最优引物。所述步骤c为(1)实验藻种基因组DNA的提取与纯化(2)PCR反应(3)PCR的优化选取18SrDNA序列，设计出引物1、引物2、引物3，其序列为引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步骤d为(I)PCR反应中Mg2+的浓度的优化(2)PCR反应中模板起始浓度的优化(3)PCR反应中引物起始浓度的优化然后进行PCR扩增。所述步骤e为将实验藻种序列信息录入excel软件，并结合实验用到的限制性内切酶的酶切信息，通过excel软件，作出酶切片段数和长度的信息，建立初级酶切信息数据表；根据模拟数据表建立的信息，进行筛选，从中挑选出限制性内切酶，运用VectorNTISuite9软件确定凝胶电泳的条件，然后对实验藻种序列进行模拟的酶切，并跑出模拟电泳图，根据此初步判断其区分鉴别程度；选取部分实验藻种进行酶切实验，并与的模拟实验结果进行比对，验证模拟实验和实际试验的吻合程度，其中，反应体系为总体积30μ1，其中18SrDNA扩增产物15μ1，酶切反应缓冲液5μ1，内切酶3μ1，灭菌重蒸水7μ1；反应时间为65°C条件下90min，其酶切产物也用凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1%，电压100V，电泳30min，然后在凝胶成像系统中进行分析。所述步骤e进一步包括如下步骤选取实验藻种对选择的限制性内切酶进行实验，作出酶切电泳图，作出单个的藻种酶切图谱，用于鉴别和区分，并对相关酶切实验条件进行优化；对照模拟实验结果和实际实验结果，构建赤潮藻种的RFLP图库，并在此基础上建立标准化的基于RELP技术的赤潮藻种分类鉴定方法，对试验藻进行了五次的重复实验，并计算条带大小；收集实验藻种18SrDNA序列信息，并综合主要限制性内切酶的信息，结合数据库和VectorNTISuite9软件，选取用酶，作出模拟电泳图，优选为TaqI酶作为实验用酶；计算模拟实验和实际实验的对比结果，计算实际实验的条带数和条带大小的位置是否与拟实验结果基本一致。所述步骤e进一步包括如下步骤(1)酶切样品量的优化取三个酶切对象的量进行优化，分别是5μ1、10μ1、15μ1，然后进行电泳分析；(2)酶切时间的优化取5个时间段对本实验进行优化，分别是90min、120min、150min、180min、210min然后进行电泳分析；(3)酶切用酶量的优化取三个酶的用量对本实验进行优化，分别是2μ1、3μ1、4μ1;然后进行电泳分析，对各验藻种进行了RFLP酶切实验，在酶切之后固定凝胶浓度以及电泳的电压、电泳时间因素，并作出其酶切图谱，用于鉴别和区分藻种。所述步骤f为对未知藻种进行培养，提取DNA，对藻种进行扩增，得到目的片段后对目的片段进行酶切，酶切后进行电泳，得到电泳图谱后对电泳图谱进行分析，对电泳图谱的分析，应根据电泳图谱中酶切样品的片段数以及片段和marker的相对位置来确定，其中，条带片段大小估算公式L=(WXC)+DL为条带分子量W目标条带所处的两条marker之间的比例位置C为条带所处的两条marker片段差值D两条marker条带中较小的一条的分子量误差为士C/10，(C为marker两条带之差值)。本发明中的藻种18SrDNA片段的获得(1)实验藻种基因组DNA的提取与纯化取30ml藻培养液加入到50ml的离心管中，8000rpm离心5分钟。用500μITE缓冲液冲洗藻细胞，放入小离心管中。加预热到55°C的抽提缓冲液(3%的CTAB;1%的Sarkocyl；20mM的EDTA,pH=8.0；14M的NaCl；0.IM的TriS-HCl；1%的α-疏基乙醇)，55°C处理30分钟至60分钟，前10分钟每5分钟颠倒混勻一次，之后每10分钟混勻一次，每次混勻时颠倒离心管3-5次，直到透明。趁热从每一管取75μ1细胞裂解液至一新离心管中。放入4°C冰箱，3分钟之后，使之冷却。每管加Iml氯仿/异戊醇(241)，轻柔颠倒使之呈乳浊状。14000rpm，4°C离心10分钟。小心取上层清液(600μ1-650μ1)至一新的离心管，加入1/10体积的NaAe(3Μ，ρΗ5.2)和2倍体积的冰冷无水乙醇。-80°C静置15分钟或-20°C静置2小时，使DNA沉淀。14000rpm，4°C离心10分钟。70%乙醇沉淀2次。常温放置干燥。用40μ1TE缓冲液溶解。(2)PCR反应反应体系:Mg2+(25mmol/L)4y1；10XPCR缓冲液5μ1；dNTP混合物(其中Τ、A、G、C各2.5mmmol/L)4y1；引物1μl(30ymol/L)；Taq聚合酶0.3μ1；DNA模板1μ1；用miIliQ水加至总体积为50μ1。程序为94°C预变性IOmin；94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸90s；30个循环；延伸720CIOmin0PCR产物用凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度1%，电压130V，电泳时间30min，之后浸入2%的EB(溴化乙锭)中15min，然后在凝胶成像系统中进行分析。(3)PCR的优化为了寻求最优的PCR实验结果，本实验分别从PCR实验的以下几个方面进行了优化①Mg2+的浓度固定PCR的其它反应条件，变化镁离子的终浓度。本实验用于梯度变化为三个梯度，为别为加入5μ1Mg2+(25mmol/L)、4ylMg2+(25mmol/L)、3y1Mg2+(25mmol/L)。终浓度分别为2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L。②DNA模板浓度固定PCR的其它反应条件，对PCR反应中DNA模板的浓度进行变化。本实验对模板的起始浓度为5个梯度，及原模板稀释10倍、20、50倍、100倍、200倍进行PCR反应。③引物的浓度固定PCR其它的反应条件，对PCR反应中引物的浓度进行变化，本实验对PCR反应中引物的浓度对东海原甲藻为三个梯度，及0.5μ1(30μmol/L)，1μ1(30μmol/L)，2μ1(30μmol/L)，其终浓度为0.3μmol/L,0.6μmol/L,L2μmol/L。对旋链角毛藻为两个梯度，为1μ1(30μπιΟ1/υ，2μ1(30μπιΟ1/υ，其终浓度为0.6μπιΟ1/1，1.2μmol/L。④退火温度固定PCR其它的反应条件，对PCR反应程序的退火温度进行变化，本实验对PCR反应中的温度分为8个梯度，每个梯度1°C从60°C降落到53°C。例如，用本发明快速鉴定赤潮藻种其中，如图1所示为整体模拟酶切电泳结果图。在模拟实验中，结合序列信息和酶切结果的初步分析，对近百种常用限制性内切酶进行了筛选，并从中TaqI酶作为实验用酶。从模拟实验结果来看，对于选取用酶TaqI，大多实验藻种的区分度比较好，在四种原甲藻中，海洋原甲藻(Prorocentrummicans)禾口东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)以及微小原甲藻(Prorocentrumminimum)区分比较明显，和三角棘原甲藻(Prorocentrumtriestinum)不能区分，但是TaqI把原甲藻和其他藻种区分开来。米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)和短凯伦藻(Kareniabrevis)以及裸甲藻(Gymnodinium)不能区分，但这三种藻的TaqI的酶切图谱一致，将它们和其他藻种区分开来。旋链角毛藻(Chaetoceroscurvisetu)禾口柔弱角毛藻(Chaetocerosdebilis)也不能区分，但这两种藻的TaqI的酶切图谱一致，将它们和其他藻种区分开来。总的来说，除了上述几种藻种以外，其他实验藻种在TaqI酶的作用下，酶切图谱区分比较明显，能把大多数实验藻种分开，是一个比较合适的实验用酶。如图2所示，DNAmarkerDL2000(长度片段分别为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)样品量5μ1③东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)样品量10μ1@东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)样品量15μ1。如图3所示DNAmarkerDL2000(长度片段分别为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②TaqI酶用量4μ1③TaqI酶用量3μ1④TaqI酶用量2μ1。如图4所示DNAmarkerDL2000(长度片段分别为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)②酶切时间为210min③酶切时间为150min④酶切时间为150min⑤酶切时间为120min⑥酶切时间为90min酶切优化实验从三个方面分别进行了优化，以寻求最佳的反应体系和反应时间。在酶切样品量的优化方面，可以看到，随着酶切样品量的增加，其亮度也在逐渐增加(图2)，但是由于内切酶本身的酶切能力的限制，所以如果样品过多，可能会导致酶切反应不完全。通过酶切样品的梯度优化，一般可以认为，加入酶切样品15μ1是一个比较合适的量。其亮度基本和marker—致，并且酶切完全。在内切酶用量的优化方面，可以看到，(图3)随着内切酶用量的增加，在时间一定的情况下，其产物条带越来越弱，从本实验得出，其酶切用酶量在3μ1的时候为理想用量。在酶切时间的优化方面，分别取五个时间段对酶切实验进行了优化(图4)，酶切时间在90min的时候其亮度比较好，其后酶切产物亮度随着时间的推移逐渐变淡。所以，总的来说，为了得带高质量的酶切片段，应对酶切实验的三个方面进行优化并确定最优条件。本实验确定为酶切样品量为15μ1，内切酶用量为3μ1，酶切时间为90mino酶切实验从三个方面进行优化并确定最优条件。本实验确定酶切样品量为15μ1，内切酶用量为3μ1，酶切时间为90min。RFLP作为一种分子多态性的实验手段，其主要功能在于对生物物种的差性的区分，作为一种用于鉴定的赤潮藻种的分子生态学手段，可以作为传统鉴定方法的补充和辅助手段。对于整个RFLP流程来说，其标准化的方式很重要，将整个流程标准化，将有利于对赤潮藻种进行快速简捷的初步鉴定。流程如下对未知藻种进行培养，提取DNA，对藻种进行扩增，得到目的片段后对目的片段进行酶切，酶切后进行电泳，得到电泳图谱后对电泳图谱进行分析，对电泳图谱的分析，应根据电泳图谱中酶切样品的片段数以及片段和marker的相对位置来确定。条带片段大小估算公式L=(WXC)+DL为条带分子量W:目标条带所处的两条marker之间的比例位置(如图23中③条带与250bp条带间距离为a,与500bp条带间距离为b，则W=a/(a+b)C为条带所处的两条marker片段差值D两条marker条带中较小的一条的分子量误差为士C/10，(C为marker两条带之差值)PCR标准反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR标准反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>TaqI酶切标准反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>酶切电泳标准体系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>例在图5中，首先判定目标藻种具有三条条带，①条带位于750bp条带以上大约五分之一处、通过条带和marker的相对位置，计算得知其片段分子量大约为750+(1000-750)/5二810bp。同理，②条带位于750bp条带以下大约五分之二处、可计算出其片段大约为650bp左右。③条带位于250bp条带以上大约二分之一处，可计算出其片段大约为350bp左右，根据以上信息可返回图库进行对比，对比得知图谱和东海原甲藻一致，即可初步判定其为东海原甲藻。为了验证公式，对东海原甲藻进行了五次的重复酶切，并计算条带大小，条带大小结果。五次重复酶切实验结果后计算条带分子量结果如下，可以看出，其相对标准偏差比较稳定，可以用来进行一个条带分子量大小的估算。验证条带大小公式的重复实验计算结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求一种赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤a、实验藻种f/2及其衍生培养基的配制b、引物设计与验证c、实验藻种18SrDNA片段的获得d、PCR优化及扩增e、模拟酶切和实际酶切对照实验f、RFLP区分鉴别赤潮藻种。2.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤a为f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高温灭菌；f/2维生素溶液向950mL蒸馏水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的储存液，定容至1L，过滤灭菌，置于4°C；f/2培养基向950mL蒸馏水中加入成分NaN03，NaH2P04'H20,Na2Si03·9Η20，，并定溶至1L，高温灭菌，储存于4°C备用；f/2-Si培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，配方同f/2培养基，不加Na2Si03·9H20；f/50培养基孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，冷却至室温后中添加40μ1营养元素，40μ1微量元素溶液，20μ1维生素溶液，补充过滤新鲜海水至1L。3.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤b为(1)实验藻种目标序列(18SrDNA)信息的获得和比对基于NCBI中的GenBankDNA序列数据库的相关信息，获取实验藻种的18SrDNA序列的相关信息，并运用DNAstar软件对序列信息进行对比，以搜寻合适的设计引物的区域；(2)实验藻种目标序列(18SrDNA)对比和引物的设计根据DNAstar软件序列对比的结果，通过PrimerPremier-v软件对引物相关条件的设置，设计出最优引物。4.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤c为(1)实验藻种基因组DNA的提取与纯化(2)PCR反应(3)PCR的优化选取18SrDNA序列，设计出引物1、引物2、引物3，其序列为引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。5.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤d为(I)PCR反应中Mg2+的浓度的优化(2)PCR反应中模板起始浓度的优化(3)PCR反应中引物起始浓度的优化然后进行PCR扩增。6.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤e为将实验藻种序列信息录入excel软件，并结合实验用到的限制性内切酶的酶切信息，通过excel软件，作出酶切片段数和长度的信息，建立初级酶切信息数据表；根据模拟数据表建立的信息，进行筛选，从中挑选出限制性内切酶，运用VectorNTISuite9软件确定凝胶电泳的条件，然后对实验藻种序列进行模拟的酶切，并跑出模拟电泳图，根据此初步判断其区分鉴别程度；选取部分实验藻种进行酶切实验，并与的模拟实验结果进行比对，验证模拟实验和实际试验的吻合程度，其中，反应体系为总体积30μ1，其中18SrDNA扩增产物15μ1，酶切反应缓冲液5μ1，内切酶3μ1，灭菌重蒸水7μ1；反应时间为65°C条件下90min，其酶切产物也用凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1%，电压100V，电泳30min，然后在凝胶成像系统中进行分析。7.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤e进一步包括如下步骤选取实验藻种对选择的限制性内切酶进行实验，作出酶切电泳图，作出单个的藻种酶切图谱，用于鉴别和区分，并对相关酶切实验条件进行优化；对照模拟实验结果和实际实验结果，构建赤潮藻种的RFLP图库，并在此基础上建立标准化的基于RELP技术的赤潮藻种分类鉴定方法，对试验藻进行了五次的重复实验，并计算条带大小；收集实验藻种18SrDNA序列信息，并综合主要限制性内切酶的信息，结合数据库和VectorNTISuite9软件，选取用酶，作出模拟电泳图，优选为TaqI酶作为实验用酶；计算模拟实验和实际实验的对比结果，计算实际实验的条带数和条带大小的位置是否与拟实验结果基本一致。8.根据权利要求6或7所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤e进一步包括如下步骤(1)酶切样品量的优化取三个酶切对象的量进行优化，分别是5μ1、10μ1、15μ1，然后进行电泳分析；(2)酶切时间的优化取5个时间段对本实验进行优化，分别是90min、120min、150min、180min、210min然后进行电泳分析；(3)酶切用酶量的优化取三个酶的用量对本实验进行优化，分别是2μ1、3μ1、4μ1；然后进行电泳分析；对各验藻种进行了RFLP酶切实验，在酶切之后固定凝胶浓度以及电泳的电压、电泳时间因素，并作出其酶切图谱，用于鉴别和区分藻种。9.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤f为对未知藻种进行培养，提取DNA，对藻种进行扩增，得到目的片段后对目的片段进行酶切，酶切后进行电泳，得到电泳图谱后对电泳图谱进行分析，对电泳图谱的分析，应根据电泳图谱中酶切样品的片段数以及片段和marker的相对位置来确定，其中，条带片段大小估算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>为条带分子量W目标条带所处的两条marker之间的比例位置C为条带所处的两条marker片段差值D两条marker条带中较小的一条的分子量误差为士C/10，(C为marker两条带之差值)。10.一种如权利要求1-9任一所述赤潮藻种快速鉴定的方法在检测浮游生物群落结构中的应用。全文摘要本发明公开了一种赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤a、实验藻种f/2及其衍生培养基的配制，b、引物设计与验证，c、实验藻种18SrDNA片段的获得，d、PCR优化及扩增，e、模拟酶切和实际酶切对照实验，f、RFLP区分鉴别赤潮藻种。本发明作为一种用于鉴定的赤潮藻种的分子生态学手段，可以作为传统鉴定方法的补充和辅助手段。本发明，基于FELP建立特征性图谱，将整个流程标准化，将有利于对赤潮藻种进行快速简捷的初步鉴定，有利于浮游植物赤潮的爆发预警。文档编号C12Q1/68GK101824481SQ20101018480公开日2010年9月8日申请日期2010年5月28日优先权日2010年5月28日发明者于志刚,张涛,甄毓,米铁柱申请人:中国海洋大学