专利名称：一种降解硫代葡萄糖甙的复合菌系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种降解硫代葡萄糖甙的复合菌系及其应用，属于应用微生物技术 领域。
背景技术：
菜粕中含有较高的蛋白含量。但是由于菜籽粕中含有植酸、单宁、粗纤维等抗营养 因子，尤其是硫代葡萄糖甙(简称硫甙)。目前已从数百种植物中发现120多种硫甙。硫甙 能引起饲用动物甲状腺肿大，从而造成其生长发育迟缓，使菜籽粕难以作为优质饲料蛋白 资源加以充分应用的原因所在，所以脱除菜籽粕中硫甙显得尤为重要。目前，脱除硫甙方法 有物理法、化学法、生物法和遗传学方法等，物理化学发往往有较好的硫甙脱除效果，但会 造成大量的蛋白质损失，同时使用有机溶剂会造成一定的环境污染、物料的干燥需要大量 的能量以及只能对其中的一种抗营养因子起脱除作用等诸多缺陷。遗传法是未来重点发展 的方向。微生物固态发酵发由于具有经济、对环境污染小、简便和脱毒彻底等优点。是目前 国内进行菜籽粕生物脱毒主要方式。然而硫甙是含有不同烃基的一类物质，烃基可以是烷烃、烯烃以及芳香烃等多种 情况，而酶又具有高度的专一性，一种酶往往只能对其中的一种物质起降解作用，单菌固态 发酵所产生酶系较单一，往往造成硫甙降解效率不高，同时当前研究菜粕硫甙降解时没有 考虑对其中的单宁、植酸、粗纤维和蛋白质的含量的影响。本实验所采用的两株霉菌具有很 好的硫甙降解效果，据报道热带假丝酵母具有较好的提高蛋白含量的能力，和热带假丝酵 母复配后，可以利用菜粕中加入的无机氮合成自身的菌体蛋白。所以两株霉菌和一株酵母 的复配菌系不仅很好的降低了菜粕中硫甙含量，而且在一定程度上降低了粗纤维的含量、 提高了蛋白含量(单宁和植酸含量基本无影响)，大大提高了菜粕的饲用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种能降解硫代葡萄糖甙的复合菌系，以及在降解菜粕中的 硫甙、粗纤维和提高蛋白质含量中的应用。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案为本发明提供的一种微生物复配菌系，是由两株霉菌和一株热带假丝酵母构成，两 株霉菌是从腐烂的菜籽粕中分离纯化得到了，一株热带假丝酵母(Candidatropicalis)由 江南大学食品学院谷物功能成分研究室提供，两株霉菌由生工生物工程(上海)有限公司 鉴定，鉴定结果为横梗霉属(Lichtheimia sp.)和土曲霉(Aspergillus terreus)，横梗霉 属(Lichtheimia sp. JN3C)已于2010年5月13日保臧于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCC M2010114。本发明的霉菌取材于腐烂的菜籽粕样品，实验初期只以硫甙降解率为指标进行菌 种的筛选，即通过初筛、复筛、发酵培养基硫甙降解率测定和复配菌株的筛选等实验最终确 定了土曲霉和横梗霉属两株霉菌。以选出两株霉菌作为基础和热带假丝酵母进行复配。
3
在15g的菜籽粕中加入3%的(NH4)2SO4作无机氮源和的葡萄糖，并选择发酵 温度30°C，料水比1 1.3，发酵时间70h的条件下，用5ml无菌水冲洗试管斜面制备菌悬 液后，以0.6ml 0.8ml 1. Oml (土曲霉横梗霉属热带假丝酵母)为配比进行固态发酵。以上条件进行固态发酵后，硫甙的降解率达90%以上，蛋白含量从38. 01 % (干 基)提高到48. 47%，粗纤维的含量由14. 5% (干基)降低到2. 78%，单宁和植酸含量略有 降低。显著的改善了菜粕的饲用品质。
图 1 为横梗霉属(Lichtheimia sp. JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)平板 培养菌落图片。图2为硫甙的降解率随时间的变化曲线。图3为发酵前后蛋白质和粗纤维的变化图。
具体实施例方式实施例1 菌株的筛选1培养基基础培养基用菜粕饼粕按1 6(g/ml)加90°C左右的水，沸水浴加热30min，冷
却后过滤，取滤液为基础培养基。分离细菌培养基基础培养基中加入牛肉膏0.05%，蛋白胨0. 15%，NaCl 0.5%, 琼脂 2%，0· 15%纳它霉素，PH7. 0-7.2。分离真菌培养基基础培养基加K2HPO4 0. 1%, KCl 0. 5%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 001 %，琼脂2%，氯霉素0. 1%，PH自然。菌种复筛培养基基础培养基去除蛋白质，过滤后加2%的琼脂，PH自然。固态发酵培养基15g经粉碎后的菜粕。2优势降解菌株的筛选2. 1菌种的分离、纯化和筛选取土壤Ig制备土壤稀释液和稀释梯度，每个稀释梯度做两个平行，将梯度稀释液 分别涂布到分离细菌培养基和分离真菌培养基中，选择适合的梯度将培养出的肉眼可见的 菌落依照形态特征差异，同时结合显微镜观察，据此可在一定程度上鉴别微生物，把平板 上的细菌接到LB培养基上，霉菌和酵母分别转接到PDA和YEPD培养基上分离纯化2 3 次，镜检以获得纯的培养物。将经过分离纯化后的细菌，酵母和霉菌转接到复筛培养基中， 细菌2天，酵母3天，霉菌5天后观察生长情况，长势很差或在复筛培养基上一直未见生长 的菌将遭到淘汰。长势较好的菌种活化后制备孢子悬液或种子液接入灭菌后的发酵培养基 进行固态发酵，测定该菌的硫甙降解率。经过上述筛选后的菌株再与热带假丝酵母进行复配，此时固态发酵培养基中加入 3%的(NH4)2SO4作无机氮源和的葡萄糖供酵母菌利用，以生产菌体蛋白。以硫甙的降解 和蛋白含量的提高为指标筛选出较优的复合菌系。硫甙的降解率测定选用氯化钯法(汪正华，魏晶石，沈俭.对菜籽饼中硫葡萄糖苷有高效降解作用的菌种筛选研究[J].微生物学杂志，2000，20(1) :57 59)。
降解率=乞 E1式中E1表示发酵前采用氯化钯法测定干基态菜粕的吸光值E2表示发酵后采用氯化钯法测定的吸光值3 结果经过菌种的初筛，分离纯化和复筛后保留下来了 13株酵母，41株细菌，13株霉菌， 再接到经过灭菌后固态发酵培养基中进行硫甙降解率测试，最终取硫甙降解较好的4株霉 菌。四株霉菌经过两株复配，三株复配和四株复配进行固态发酵，以硫甙降解率为指 标进行筛选，最终选择霉菌C4和C8复配组合。霉菌C4、C8和热带假丝酵母复配后，复合菌系的硫甙降解率在70h达到最高。此 时硫甙降解率达到90%以上，见附图2。附图中在Oh也有一定的降解率，是因为经过高压 蒸汽灭菌后，硫甙的含量也有一定的降低。实施例2菌种的配比对硫甙降解率和蛋白含量的影响酵母种子液的制备酵母菌在YEPD固体试管斜面上活化3天后，挑取一环到 250ml三角瓶装有50ml的YEPD液体培养基中，120r/min, 28°C摇床培养16h左右，制的酵母 种子液。孢子悬液的制备霉菌在PDA斜面培养基上活化5天左右，在转接到另一试管斜 面，待孢子成熟后，用5ml的无菌水冲洗斜面制的孢子悬液。固态发酵培养基中再加入3%的(NH4)2SO4作无机氮源和的葡萄糖，并选择发 酵温度30 °C，料水比1 1.3，取不同体积的孢子悬液和酵母种子液复配，霉菌和酵母的接 种量和复配情况见表1。发酵70h后测定硫甙降解率和蛋白质含量(此时的菜粕不作灭菌 处理，且刚把水加入到菜粕后，菜粕呈泥状，传质和传热效果差，所以加入水的菜粕放置一 段时间，使得含水的菜粕较松散)。表1霉菌和酵母的复配比例(单位ml)
C4_C8_酵母
1θΓθ08 Γο"
20.61. O0.8
30.80.61.0
40.81.00. 6
51.00. 60.8
61.00. 80.6 70. 80.80.8 发酵后的蛋白含量=(总氮_无机氮)Χ6. 25。总氮的测定采用凯式定氮法，无机 氮的测定硼酸吸收法(张秀英，王琳，张有娟，等.无机铵盐中氮含量测定方法的改进[J]. 化学研究与应用，2001，13(6) =699-700.)并一些修改。
经过上述条件进行固态发酵后，测定各水平的硫甙和蛋白质含量，最终确定以 C4 C8 热带假丝酵母为0. 6ml 0.8ml 1. Oml的配比降解硫甙和提高蛋白含量最好。 其中硫甙的降解率为93.5%，达到了在灭菌条件下的硫甙降解率。蛋白含量从38. 01% (干 基)提高到48. 47%，见附图3。为了综合评定菜粕的营养价值，选择水平1的发酵组合，测定发酵前后的的粗纤 维、单宁和植酸含量变化以及发酵后菜粕的回收率情况，结果显示粗纤维从14. 5% (干 基)降低到2. 78%。单宁和植酸含量略有降低。菜粕的回收率为88.7%。发酵后大大改 善了菜粕的饲用价值。实施例3菌种的鉴定1. 1菌株的形态学观察将菌株接到固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间观察菌种的平板菌落形 态。1. 2菌种的分子生物学鉴定本实验分离到的菌送往生工生物工程(上海)有限公司进行鉴定。1. 3 结果1. 3. 1平板形态学鉴定菌株C4在PDA平板上5天后，菌落层薄、小、圆。孢子头密集，表面呈细分装，土黄 色到黄褐色，分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层。见附图1。C8号菌株在PDA平板上培养 48h后，菌落直径可达到6cm左右，群体形态类似棉花状，在37 °C条件下仍可生长，培养过程 中菌落逐渐由白色变为灰色。孢子囊光滑透明，形状呈椭圆或梨形。见附图1。1. 3. 2分子生物学鉴定两株霉菌由生工生物工程(上海)有限公司鉴定完成，C4的序列鉴定的结果为土 曲霉(Aspergillus terreus)。IS067 C4 ITS rDNA 567bpCGAGTGCGGGTCTTTATGGCCCAACCTCCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT
6^ . .Max Total Query E Max ,,,
AccessionDescription~ ~ Links
score score coverage value ident
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 10213 18S ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ1619H. 1 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence ； and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/IICPF 5704 ISS ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ461903. 1 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1.048 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3960 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, CQ461902. 1 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3706 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, GQ461901.丄 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence； and 28S ribosomal RNA gene，partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3355 18S ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ461900. 1 5. 8S ribosomal KNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2， complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceC8序列鉴定结果为横梗霉属(Lichtheimia sp.)。IS039C8 ITS 区685bpCATTACTGAGAGGTTATTAAGACTCTTGGGTTGAGTTTCTTTGCTCTTCTCTTGAGTTTCCTCACGGTTTTGTGCAATGTTGGGTCACCTTGGTTGACTCTGCCCTAAGTATTGGGCTGGCCTTTGGGGCCCCTAGTATGATTTATCATACTAACCCCAGAGGTTATTTCTACTATGTCTATGAATTGATGTATGAAAAAGTTATTT GTTAACTTGAAGGCTTTTCTGTAAAAAGTGAGTCTTTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCGATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGTCAATCTACTAGGCACAGTTGTTTCAGTATCTGCATCCACCAATCAATACAACTTGCTTGTGTTGGAACTGGGCTTACTTTTGATGGCATTTGGTTGCTGTCATGGCCTTAAATGTATTTAGTCCTAGGTGTTAACTTGTTAATGCCGGATGGAGACTCTAGAGTGCCTTAGAAGCAGCTTGGTTAGTGAGTTCATAATTCCAAGTGTTAGTCTTTTATTGAACTGGGTTTCTAGTCTATGGGACTTACT T
GAGAGTCGACCTCTCTAGTAAATCAAACTCACATCTAGATCTGAAATCAACTGAGATCACCC
1048 100% 0.0 100%
1048 100% 0.0 100%
1048 100% 0.0 100%
1048 100% 0.0 100%
1048 100% 0.0 100%Lichtheimia '.p CNPMA/f 05-100 18S nb^omal RNA gene, oar+inl 5 Lir.hrheirnia AA J-009a culturp-roilectiun CNM .:M-U97S clnn^ Uchthei mj a sc. AA-2009a culture-col Iecti on CBS;958,68 clone 2 ISS Lichtheimia so. AA-2009a culture-collection CBS;291,66 clone 2 IR ftbsidi^ corvmbifera clone bandFll internal transcribed s Absidia corymbifera internal transcribed soacer 1, cattial ！ Absidia corymbifera done bandFiO internal transo*ibtd §oac r 1, D^ Lichtheimia corvmbifera culture-collection CBS:4Z9.75 dom I IQS Lichtheirnia corYmbifera stra，n CBS 429.75 18S Hbosomai RNA aem Lichtheimia corymb if era culture-collection CBS:519, 1 clone 4 IBS Lichtheimia corYmbifera strain UMIP 1280,81 16S nbosoma! RNa ae Absidia corvmbifera strain IP 1280>81 18S ribosomai RNA gene, oar Uncultured comoost funqus 18S rRNA aene (partiet), ITSl, 5 8S rR卜 Uehthgirma cor^mbif&ra $trmn CfiRMA/F 0B-S4 ISS ribosomd RWA . Uchtheimia corvmbifera stra'm EES 227 18S nbosomal RNA qene, D Lichfheimia corvmbifera strain CMRMfi/T 08-24 US nbosomal RfJA Uchtheirnia corvmbifera strain C眺MA/F OS-4 18S ribesomal RNA Uchtheimia corvmbifera strain CMR^A/F 01-97 I8S ribasomal RMA . Uchtheimia con— strain CNRMft/F 07-88 ISS rib0soma! RNA ‘ Uchtheimia corvmbifera stram CMRMA/F 07-76 I8S nbosomal RNA · Lichtheimis corvmbifera strain O^Ma/F 06-32 18S ribosomal RMA -Lichtheimia Wr^mbifera strem CBS 101040 16S nboiornal RHA aen Uchtheimia co_bifftra strain CNRMA/F 04-14 18S nbosomal RNA -Lichtheimia corvmbifera strain CNR^lA/F 03-82 18S nbosomal RNA , Mycodadus corvmbiferus isolate South-west004 IBS nbosomal RWA Absidia sp, N20 18S ribosomai RMA gene, partial珍；internal
UncuHurnd comoost funaus IBS rRNA aene (partial). ITSl, 5.BS rRt、 Mycocladus corymbifergs strain WM 06,89 internal transcribed spac FunqaI sd- dOY-13 18S ribosomal RNA aene, partial seauersce: intei Absi小a corvmbifera strain CNRMA 03.69 18S ribosomai RNA aene Absidia corvmbifera strain CMRMA 03,611 18S ribosomai 謂A Qene Absidia corvmbifera strain IP 1129.75 18S ribosomai RNA aene, DSf
98% BS% §8% 8Θ% 86% B8% 8S% 88% sa% 88% 88%
Iy Si = HESI二Esifls
权利要求
一种高效降解硫代葡萄糖甙(简称硫甙)的复合菌系及其应用。其特征在于其复合菌系由二株霉菌和一株热带假丝酵母构成，两株霉菌是从腐烂的菜粕中分离而得，序列鉴定结果为横梗霉属(Lichtheimia sp.JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)。横梗霉属已于2010年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2010114。一株热带假丝酵母菌由江南大学生工学院友情提供。
2.如权利1所述的复合菌系的应用，其特征在于所用的复合菌系用于降解菜籽粕中 硫试。
3.如权利1所述的复合菌系的应用，其特征在于所用的复合菌系用于降解菜籽粕中 的粗纤维。
4.如权利1所述的复合菌系的应用，其特征在于所用的复合菌系用于提高菜籽粕中 的蛋白含量。
5.如权利1所述的复合菌系，其特征在于土曲霉、横梗霉属和热带假丝酵母的复配比 为 0. 6ml 0. 8ml 1. 0ml。
全文摘要
本发明公开了一种降解硫代葡萄糖甙(简称硫甙)的复合菌系，这种复合菌系由两株霉菌和一株热带假丝酵母复配而成。两株霉菌是从腐烂的菜籽粕中筛选而得，序列鉴定的结果分别为横梗霉属(Lichtheimia sp.JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)。横梗霉属(Lichtheimia sp.JN3C)已于2010年5月13日在中国典型培养物保藏中心保藏。保藏编号为CCTCCM2010114。热带假丝酵母由江南大学生物工程学院友情提供。本发明属于微生物应用技术领域。本发明还公开了这种复合菌系在降解菜籽粕中硫甙、粗纤维和提高蛋白中的应用。土曲霉、横梗霉属和热带假丝酵母的复配比为0.6ml∶0.8ml∶1.0ml，经固态发酵后对菜籽粕中的硫甙降解率达到90％以上，蛋白含量提高到48.47％(干基)，粗纤维含量从14.5％(干基)降低到2.78％。在菜籽粕的生物脱毒和品质改良中具有很好的利用价值。
文档编号C12N1/00GK101899396SQ20101018470
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者王兴国, 王小三, 金青哲 申请人:江南大学