专利名称：一株降解烷烃功能菌、其培养方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一株能降解烷烃的功能菌、其培养方法及其应用方法。
背景技术：
随着环境污染的日益严重，微生物治理废水的研究和利用越来越被人们重视。传统的活性污泥法处理废水利用的是自然的或是经过一定驯化的微生物菌群，任其自然降解，污染物的降解速率不高，已不能适应当今越来越多的工业废水种类。目前国际上兴起的生物强化(Bioaugmentation)是以提高生物处理过程的稳定性和污染物处理效率为目的的新兴技术，针对传统生物处理技术部能有效降解有毒有害的污染物，利用现代生物技术选育优势菌种、构建基因工程菌，突破了过去传统生物处理反应器的微生物菌种靠生活污泥进行培养或驯化的低效模式，通过直接投加高效菌种，有选择的将有害物质去除，使环境形成一个有益的良性循环过程，所花费的成本也会大大降低。因此，环境生物菌剂的研制是目前污水环境生物处理技术最具发展潜力的方向之一。
国际上许多环境生物技术成果已进入商品化、产业化发展。生物技术是水污染控制中最成熟也是最富有挑战性的技术，在国外的环保产业中——直是市场占有量最大的。随着经济的发展，新污染治理的需要，新技术、工艺设备不断出现并产业化，美国在此领域内的年市场额达数百亿美元，数十项环境生物技术产品已获得有关国家政府部门的许可。并进行野外应用实验。美国还成立了相当数量的环境生物技术专业公司，部分产品已占领了国际市场。而生物强化技术应用的关键问题是微生物生产成本过高，作为活菌制剂的生产要获得高收率、高活力的菌液十分不易，难以大批量生产。而用一般发酵工艺生产，发酵液中的菌体浓度仍较低，难以获得理想效果。因而现有技术极大的限制了该项技术的推广和应用。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺点和不足，提供一株降解烷烃的功能菌、其培养方法及其应用。
该菌株为短状杆菌属(Brachybacterium Collins)，菌株基本生物学特性不规则杆状，有时形成球，革兰氏反应阳性，不运动，好氧。菌落成浅黄色，不产芽孢，生长温度20-50℃，PH 5-9，从葡萄糖，麦芽糖产酸，还原NO3--NO2-。该菌株已经提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO1262，保藏日期为2004年12月8日。
本发明中涉及的菌株是从炼油厂污泥中分离纯化得到的，经实践证明，对炼油废水中的烷烃，COD降解能力很强，具有较大的应用价值。通过对培养基配方的研制和发酵条件的探索，在不降低该菌的降解性能的条件下，菌液的发酵密度可达1013个/mL.为生产降解石油废水的微生物菌剂提供了一种高密度发酵工艺。
本发明菌株的液体发酵工艺包括菌种活化、摇瓶种子培养、发酵和处理石油废水等步骤(一)菌种活化斜面与摇瓶液体培养基牛肉膏0.1-1％蛋白胨0.1-1％NaCl 0.1-0.5％
水100g固体培养基加0.5-1.5％琼脂用接种环从冷冻保藏的菌种斜面培养基上取少许菌种，接种至新配制的斜面培养基上进行培养，从而对冷藏的菌种进行活化以利于实验的进行。
(二)摇瓶种子培养从活化的菌种斜面培养基上取少许菌种，接种至装有已灭菌的液体培养基100mL的三角瓶(250mL)中，在35℃、145r/min的条件下摇床培养18小时。
(三)发酵罐发酵发酵罐培养基配方玉米粉0.2-0.8％MgSO4.7H2O 0.2-0.8％豆饼粉0.2-1.0％。
炼油废水 适量豆油 0.1-0.2％调节PH值为6-7发酵罐在接种前和投料前分别灭菌，可用121℃/0.11Mpa灭菌30分钟，培养基冷却至35℃时接种，接种量为1-10％，培养温度为30-40℃，搅拌转速为＞200r/min，通气量＞1∶1.2v.v.m(每分钟单位体积培养基含同体积空气量)，发酵至10小时，可适量的补加碳源和氮源，发酵时间为16-20小时，活菌数达1013个/mL，可停止发酵。
(四)将菌液在无菌条件下进行灌装，低温保存。
制备的产品主要指标为活菌数大于100亿个/g；pH＝6-7
本菌株应用方法为在含有长链烷烃(C10-C20)的含油废水中，废水COD＝0-3000，pH值＝5-9中，按照10％(菌液活菌数大于100亿个/mL)比例接种上述培养制得的菌液，采用间歇换水的方式，待挂膜后再在进水中逐渐增加含油废水的比重，直至进水全部为含油废水为止，通过爆气水中溶解氧含量3-4mg/L。即可对含油废水进行处理。
本发明的优越之处(1)工艺简单，工艺路线短.
(2)发酵液光密度高，活菌数可达1013个/mL。
(3)在培养基中加入石油废水，发酵后不降低菌株的降解性能。
(4)发酵所得菌剂对石油废水处理效果显著。
具体实施例方式测定废水的各种理化指标，COD值采用重铬酸钾法测定，正十六烷采用气相色谱法测定。
1将高温灭菌处理(121℃、30分钟)过的固体培养基定量备用，固体培养基的配方为牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g、琼脂1.5％。
2预制菌种并将预制好的含降解烷烃菌种接种至灭菌固体培养基中活化备用。
3进行菌种扩增将活化后的菌种接种至液体培养基(液体培养基配方为牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g)，中振荡(35℃，160转/分钟)培养18小时，培养菌液0.5L。
4在10L种子罐中配制6L发酵培养基，培养基配方为玉米粉0.8％，MgSO4.7H2O0.8％，豆饼粉1.0％，炼油废水75％，豆油0.2％。在121℃/0.11Mpa压力下灭菌30分钟。
5将扩增培养菌液0.5L接种至10L种子罐开始发酵，控制PH在6(10％NaOH调节)，培养温度35℃(以冷却循环水控制)，搅拌转速在400r/min，通气量1∶1(v.v.m)条件下培养16-18小时，既可移种至发酵罐内培养，此时种子罐发酵液菌量达1011个/mL，停止发酵。
6将菌液在无菌条件下进行灌装，低温保存。
7使用方法在SBR反应器中按10％加入量加入菌液，采用间歇换水的方式，每天换水2次，待挂膜后再在进水中逐渐增加炼油废水的比重，直至进水全部为炼油废水为止，同时做只加活性污泥和空白(不加活性污泥和菌液)的对照实验，稳定后连续处理5天，每天测定出水的COD值和正十六烷含量，处理效果如下表所示
由上表可知，处理5天后加入菌液的处理效果最好，COD去除率最高。
由上表可知，加入菌液的炼油废水中正十六烷含量由进水56mg/L降为0.06mg/L。
权利要求
1.一株降解烷烃功能菌，为短状杆菌属(Brachybacterium Collins)，于2004年12月8日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO1262；菌株不规则杆状，有时形成球，革兰氏反应阳性，不运动，好氧。菌落成浅黄色，不产芽孢，生长温度20-50℃，PH 5-9，从葡萄糖，麦芽糖产酸，还原NO3--NO2-。。
2.权利要求1所述的降解烷烃功能菌的放大培养包括采用下述培养基进行菌种活化、摇瓶种子培养牛肉膏0.1-1％，蛋白胨0.1-1％，NaCl0.1-0.5％，水100g，优选为牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g，摇瓶种子培养条件为35℃、145r/min和18小时；发酵培养采用培养基玉米粉0.2-0.8％，MgSO4.7H2O0.2-0.8％，豆饼粉0.2-1.0％，炼油废水适量，豆油0.1-0.2％，调节PH值为6-7，优选为培养基配方为玉米粉0.8％，MgSO4.7H2O 0.8％，豆饼粉1.0％，炼油废水75％，豆油0.2％。
3.权利要求2中所述菌种活化和摇瓶种子培养所用培养基可以加入加0.5-1.5％琼脂作为固体培养基。
4.权利要求2中所述发酵培养方法为培养基冷却至35℃时接种，接种量为1-10％，培养温度为30-40℃，搅拌转速为＞200r/min，通气量＞1∶1.2v.v.m每分钟单位体积培养基含同体积空气量，发酵至10小时，可适量的补加碳源和氮源，发酵时间为16-20小时，活菌数达1013个/mL。
5.权利要求1所述的降解烷烃功能菌的使用方法在含有C10-C20长链烷烃的含油废水中，废水COD＝0-3000，pH值＝5-9中，按照10％比例接种菌液，采用间歇换水的方式，待挂膜后再在进水中逐渐增加含油废水的比重，直至进水全部为含油废水为止，通过爆气水中溶解氧含量3-4mg/L。
全文摘要
本发明属于环保领域。针对目前石油废水处理中存在的问题，本发明公开了一株降解烷烃的功能菌、其培养方法及其应用。本发明菌株从炼油厂污泥中分离纯化得到，为短状杆菌属(Brachybacterium Collins)，采用放大发酵培养后得到的菌液处理含有C
文档编号C02F3/02GK1789408SQ20041008150
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者严平, 李旭东, 杨俊仕, 廖银章 申请人:中国科学院成都生物研究所