一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法及其试剂盒的制作方法

专利名称：一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法及其试剂盒的制作方法
一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法及其试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种扩增方法，具体地说，是关于一种多重连接与延伸依赖的探针扩 增方法及其试剂盒。
背景技术：
目前，多重连接依赖的探针扩增技术(Multiplex Ligation dependent ProbeAmplification, MLPA)是一项在科研与临床检验中广泛使用的中等通量的检测多个 DNA位点的分子生物学技术。整体而言，MLPA是一种多重PCR的技术。能够同时探查多达 50个基因组DNA位点的拷贝数目异常，最少甚至能区分一个核苷酸的序列差异。MLPA在反 应中，设置50对左右的探针，每对探针特异性的检测一段靶序列，经过一次PCR反应，同时 检测所有探针的剂量，并进而检测不同探针所对应靶序列的剂量(或拷贝数)。与常规多重PCR不同，MLPA反应过程中，扩增的并不是靶序列，而是那些与靶序列 复性杂交并被连接的探针。相对于常规的多重PCR，MLPA反应的PCR步骤仅需要一对通用 引物。MLPA扩增的产物长度从IOObp至500bp不等，可通过毛细管电泳进行区分。同时通 过电泳结果中，不同条带的片段长度与峰值，可以判断出相应探针对应的检测位点的拷贝 数变化。MLPA整个试验过称可被分为5个步骤1) DNA变性并与MLPA探针进行杂交；2)连 接反应；3)PCR反应；4)PCR产物通过毛细管电泳分离；5)电泳结果进行数据处理。MLPA针对每一个靶序列设计一对寡核苷酸探针，分别称为左、右探针。左探针的 5’端为通用引物X，3’端为其与靶序列的杂交区。右探针的5’端为其与靶序列的杂交区， 3’端为通用引物Y的互补区。左、右探针的杂交区在靶序列上紧密相连，而MLPA使用的连 接酶只能连接杂交在同一序列并紧密相连的两段序列，因此，只有当相应的左右探针都正 确杂交到相应的靶序列区时，连接反应中左右探针才能被连接。通用引物区与杂交区间可 插入填充序列以调节探针序列总长。MLPA针对不同的靶序列设计的探针其杂交区与填充序 列不同，但是都携带相同的通用引物区X与Y。通过填充序列的选择和调整，可使得不同的 探针对总长各不相同，这样在后续的毛细管电泳中能根据长度不同进行分离。在MLPA反应中，首先，模板DNA变性，并与MLPA探针混合孵育杂交过夜。在这个 过程中，相应的探针与靶序列复性杂交。杂交完成后，加入连接酶，只有正确杂交的左右探 针才能被连接。在接下来的PCR过程中，加入荧光标记的通用引物X、未加荧光标记的通用 引物Y以及DNA多聚酶，那些未连接的探针因为只含一个通用引物区，在PCR过程中不能被 扩增，也不会含有相应的荧光信号，而只有连接的探针才能够被扩增，所以探针连接产物的 数量与模板DNA中靶序列的数量对应成正比。PCR扩增产物通过毛细管电泳分离。这样，在一次MLPA反应中，可有多达50个靶序列被检测，用相关软件分析电泳结 果，可知不同探针所检测的靶序列的缺失，扩增及拷贝数异常。MLPA作为一项简单、实用、稳 定的中等通量DNA检测技术，被广泛应用于临床与科研中。但是，由于MLPA技术的原理特点，MLPA技术仅能用于检测保守的、不具有多态性的DNA位点，并不能用于检测具有长度多态性的DNA位点，如短串联重复序列位点(short tandem r印eats，STR)，这使得MLPA技术的进一步应用受到限制。同时，由于MLPA技术的探 针中需要插入填充序列，在探针制作时，需要使用M13噬菌体培养，费时、复杂且成本较高。STR广泛存在于人类和其他生物体基因组中。其核心序列一般为2_6bp，核心序列 重复次数的不同形成了丰富的遗传多态性。由于STR遗传标记数量众多，杂合度高，特异且 稳定，使得其成为目前遗传学分析最重要的遗传标记之一，被广泛应用于重组作图，群体遗 传学和连锁分析中。尽管STR位点的应用如此广泛，目前其主要检测方法仍为单一 STR位 点的PCR检测，费时费力。由于STR存在重复序列，扩增相对较为困难，因此，目前尚没有一 种技术能够灵活地针对多个STR位点进行分型。如果能够开发一种简单，快速，灵活的中等 通量的STR分型检测技术，其应用前景将会非常广阔。

发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多重连接与延伸依赖的探针扩 增方法。本发明的再一的目的是，提供一种能够同时扩增与检测多个DNA位点试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法，所述的方法包括如下步骤(1) DNA靶序列变性并与MLEPA探针进行杂交；(2)延伸与连接反应；(3) PCR 反应；(4) PCR产物通过毛细管电泳分离；(5)电泳结果进行数据处理；所述的延伸与连接反应是同时使用DNA多聚酶与连接酶的延伸与连接反应。方法步骤(1)中所述的MLEPA探针是根据DNA靶序列设计的寡核苷酸左探针和寡 核苷酸右探针，左探针的5’端为通用引物X区，3’端为其与靶序列的杂交区，右探针的5’ 端为其与靶序列的杂交区，3’端为通用引物Y的互补区，寡核苷酸左探针和寡核苷酸右探 针的杂交区在DNA靶序列上有一段间隔序列，待检具有长度多态性的DNA位点置于该间隔 序列中，通过后续的反应检测该间隔序列中的待检位点的重复情况与长度多态性。所述待检DNA位点可以是具有长度多态性STR位点。所述的待检DNA位点也可为不具长度多态性的保守DNA位点。所述的STR 位点选择是 D5S112、D5S435、D5S557、D5S351 和 D5S610。所述的保守DNA位点的选择是AR基因、SRY基因和BRCA2基因。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种能够同时扩增与检测多 个DNA位点试剂盒，包括寡核苷酸左探针、寡核苷酸右探针、DNA多聚酶、连接酶，所述的试 剂盒还包括多重连接与延伸依赖探针扩增方法的探针组，所述的探针组中至少有两对根据 待检位点设计的探针。本发明为了提供一种能够同时检测多个STR位点的稳定、灵活的技术，针对 MLPA技术在STR位点检测上的缺陷，我们改进并发明出一种新的检测技术——多重连 接与延伸依赖的探针扩增技术(Multiplex Ligation and Extensiondependent ProbeAmplification, MLEPA)。相对于MLPA技术，这种MLEPA技术不仅能够检测保守的唯一的 DNA序列，而且还可以进行多个具有长度多态性位点的检测，在STR位点的应用与研究上有 很大的前景。本技术针对传统MLPA技术不能检测具有长度多态性的DNA位点的缺点，解决的技 术方案是MLEPA技术的基本反应与MLPA类似，同样包含5个步骤1) DNA变性并与MLEPA探 针进行杂交；2)延伸与连接反应；3)PCR反应；4)PCR产物通过毛细管电泳分离；5)电泳结 果进行数据处理。相较于传统MLPA的原理特点，MLEPA最大的变化是第二步将MLPA第二步仅使用 连接酶的连接反应，改进为同时使用DNA多聚酶与连接酶的延伸与连接反应。这一改变使 得MLEPA在第二步不仅存在连接反应，同时也存在延伸反应。这也导致MLEPA的探针设计 与MLPA不尽相同。针对每一个靶序列，MLEPA同样设计一对寡核苷酸探针，分别称为左、右 探针。左探针的5’端为通用引物X，3’端为其与靶序列的杂交区。右探针的5’端为其与 靶序列的杂交区，3’端为通用引物Y的互补区。但是，不同于MLPA探针设计，由于第二步存 在延伸反应，MLEPA的左、右探针的杂交区在靶序列上并不需要紧密相连，而是可以在其间 存在一段间隔序列。正是由于这段间隔序列的存在，MLEPA可在探针设计时有意将待检STR 位点置于该间隔序列中，并通过后续的反应检测该间隔序列中的STR位点的重复情况与长 度多态性。同时，通过间隔序列的调整，可使得不同的MLEPA探针对总长各不相同，这样在 后续的毛细管电泳中能根据长度不同进行分离。因此，MLEPA也不需要在探针中设置填充 序列用于区分最终产物长度。MLEPA反应的整体流程为在第一步中，模板DNA变性，并与MLEPA探针混合孵育 杂交过夜。在这个过程中，相应的探针与靶序列复性杂交。杂交完成后，加入DNA多聚酶和 DNA连接酶，正确杂交的左右探针其左探针首先被DNA多聚酶延伸至右探针5’处，然后通过 连接酶将已延伸的左探针与右探针连接起来。在接下来的PCR过程中，加入荧光标记的通 用引物X、未加荧光标记的通用引物Y以及DNA多聚酶，只有完成延伸连接的探针才能够被 扩增，那些未连接的探针因为只含一个通用引物区，在PCR过程中不能被扩增，也不会含有 相应的荧光信号。PCR产物通过毛细管电泳分离，在一个MLEPA反应中，针对不同的STR位 点设置多对探针，就能在一次反应中同时检测多个STR位点。本发明的有益效果是(1)可以在一次反应中同时进行多个STR位点的检测。(2)由于其探针设计的灵活，MLEPA技术可被灵活广泛的应用到各类型STR位点的 检测中。(3)在原理上，MLEPA技术也能类似于传统MLPA技术应 用于多个保守DNA位点拷 贝数的检测。(4)MLEPA技术由于探针中不需要填充序列的存在，因此人工快速合成的寡核苷酸 单链就可以满足需求其探针制作的需求，在探针制作中不需要使用M13噬菌体培养，相对 于传统MLPA技术，快速、简单，成本也相对更低。
图1是MLEPA的反应原理示意图。图1中A表示MLEPA模板变性与探针杂交步 骤；B表示MLEPA延伸与连接步骤；C表示MLEPA的PCR步骤；D表示MLEPA的PCR产物进行 毛细管电泳与分析的步骤。图1中，1.左探针5’端通用引物X区；2.左探针3’端靶序列 杂交区；3.右探针5’端靶序列杂交区；4.右探针3’端通用引物Y互补区；5. DNA靶序列； 6. DNA多聚酶；7.连接酶；8. PCR通用引物Y。
图2是实施例1中待检家系SMA产前诊断STR连锁分析MLEPA结果。图2中左侧 为该家系MLEPA产物电泳结果图，右侧为根据MLEPA结果分析所得的该家系SMA产期诊断 STR连锁分析图。图2中左侧A表示该家系父方MLEPA产物电泳结果图；B表示该家系母方 MLEPA产物电泳结果图；C表示该家系先证者MLEPA产物电泳结果图；D表示该家系待检胎 儿MLEPA产物电泳结果图；E表示MLEPA电泳结果中代表D5S112位点的峰值范围；F表示 MLEPA电泳结果中代表D5S435位点的峰值范围；G表示MLEPA电泳结果中代表D5S557位点 的峰值范围；H表示MLEPA电泳结果中代表D5S351位点的峰值范围；I表示MLEPA电泳结果 中代表D5S610位点的峰值范围。图2中右侧家系成员下方显示的是STR基因型，STR位点 从上(着丝粒侧)至下(端粒侧)分别为D5S435, D5S557, D5S610, D5S351和D5S112。箭 头所指为先证者。与疾病连锁的单倍体用黑色表示，正常单倍体用白色表示。图3是实施例1中待检家系SMA产前诊断STR连锁分析单一 STR PCR结果，表示的根 据单一 STR PCR分析所得的该家系SMA产期诊断STR连锁分析图。家系成员下方显示的是STR 基因型，STR位点从上(着丝粒侧)至下(端粒侧)分别为D5S435，D5S557，D5S610, D5S351和 D5S112。箭头所指为先证者。与疾病连锁的单倍体用黑色表示，正常单倍体用白色表示。图4是实施例2中3例样本的性染色体倍性检测MLEPA电泳结果峰图。图4中A 表示空白对照样本，B表示1号样本，C表示2号样本，D表示3号样本。箭头1所指为通用 引物PCR 二聚体峰，箭头2所指为检测AR基因的MLEPA产物峰，箭头3所指为检测SRY基 因的MLEPA产物峰，箭头4所指为检测BRCA2基因的MLEPA产物峰。
具体实施方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
作详细说明。具体实施例1 :MLEPA应用于STR位点的检测——脊肌萎缩症产前基因诊断STR连 锁分析的MLEPA检测脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是最常见的儿童致死性常染色体隐 性遗传病之一，人群发病率约为1/10，000，致病基因人群携带率约为1/50。SMA以脊髓前 角运动神经元变性为主要病理特征，临床表现为下运动神经元损害所致的进行性、对称性 肌无力和肌萎缩。呼吸肌受累所致的呼吸系统并发症是导致多数患儿死亡的主要原因。位 于5号染色体长臂5ql3. 3区域的运动神经元存活基因l(survival motor neuron gene 1， SMN1)为该病的致病基因。现有研究表明，约95%的SMA患者由SMm纯合缺失所致。由于 SMA患儿的父母多数为SMA携带者，患儿母亲再次怀孕仍有25%概率生育SMA患儿。因此 对风险胎儿进行产前基因诊断，是预防SMA的有效措施。SMA 产前诊断中可通过 PCR-酶切法(PCR-restriction fragment 1 engthpo 1 ymorphism, PCR-RFLP)直接检测SilNl基因7号外显子纯合缺失判断胎儿是否受累。然而，作为排除母源污染、验证PCR-RFLP结果以及判断携带情况的手段，连锁分析在 SMA产前诊断中仍然具有非常重要的作用。STR连锁分析是一种传统的产前基因诊断方法， 自1992年以来，文献报道中共有10余种STR位点被应用于SMA产前诊断中。国内目前已 有多篇采用STR连锁分析配合其他方法进行SMA产前基因诊断的报道。我们应用5个在SMA产前诊断中广泛应用的STR位点(D5S112、D5S435、D5S557、 D5S351和D5S610)，针对这些位点设计MLEPA探针组，应用MLEPA技术对这5个位点同时进 行检测。我们将这套探针应用于一例SMA产前诊断的STR连锁分析中，并应用传统的单一 STR PCR对MLEPA的结果进行验证。在此例进行SMA产前诊断的家系中，存在一名SMA的先证者，曾在我院临床诊断为 SMA，经PCR-酶切基因诊断确诊为SilNl 7号外显子纯合缺失。先证者的母亲再次怀孕，胎儿 为SMA高危人群，要求进行SMA产前基因诊断。SMA家系成员(父方、母方与先证者)抽取 外周血2ml，EDTA抗凝。用于产前诊断的胎儿样本来自高危孕妇孕17 19周羊水，由我院 产科在B超引导下抽取，经离心收集常规培养后分析。外周血和培养羊水细胞使用TOPure 血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA (购自上海基因科技公司)。提取的家系基因组DNA样 本溶于TE中，调节至浓度50 lOOng/ul待用。MLEPA实验分析方法
1.探针组与通用引物的设计与制作针对5个待检的STR位点设计MLEPA探针，设 计原则如前所述(已设计探针均由上海生工合成)，其中右探针5’端均进行磷酸化。将5 对设计好的MLEPA探针混合至终浓度2 5nM，溶于TE中，制作成为MLEPA探针组混合液。 设计合成通用引物X与Y，其中通用引物X于5’端标记6-FAM荧光标记，用于后期PCR产物 的毛细管电泳。(表1)表1应用于SMA产前诊断STR连锁分析的MLEPA探针与通用引物信息表中L表示MLEPA左探针，R表示MLEPA右探针。 2. MLEPA反应:MLEPA反应杂交步骤，延伸与连接步骤所用的反应缓冲液以及连接 酶Ligase-65均购自MRC-Holland公司(阿姆斯特丹，荷兰)。1)杂交步骤5ul DNA样本98°C5min预变性，接着冷却至25°C，加入1. 5ul的MLPA buffer与1. 5ul的MLEPA探针组混合液，95°C 2min后于60V杂交16个小时。2)延伸与连接步骤8ul杂交过夜的样本中加入32ul延伸与连接混合液(延伸 与连接混合液由 3ul Ligase-65Buffer A，3ul Ligase-65 Buffer B, Iul IOmM dNTPs, Iul Ligase-65连接酶，0. 2ul r-Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司)和23. 8ul ddH20组成)，54°C反应20min后，98°C 5min终止反应，得到40ul MLEPA延伸与连接产物。3)PCR反应25ul PCR体系包括5ul MLEPA延伸与连接产物，4ul 5M的 Betaine (购自美国 Promega公司)，0. 5ul IOuM的通用引物X与 Y，12. 5ul ^ 2XPremix Taq Hot Start Version (购自大连宝生物公司)和2. 5ulddH20。置于东胜龙PCR仪(北京东胜 创新公司)进行反应。PCR反应程序为98°C预变性3min ；95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin， 35 个循环；72°C 20min，4°C 保存。4) PCR产物使用3730DNA分析仪(美国ABI公司)进行毛细管电泳后，经 GeneMapper软件分析PCR产物片段长度。同一 STR位点不同的PCR产物长度可判断为不同 的等位基因型，根据PCR产物的长度进行STR分型与家系连锁分析。单一 STR PCR实验分析方法
1. PCR引物设计针对5个待检的STR位点设计单一 PCR引物(已设计引物均由 上海生工合成)，每对引物的正向引物对其5’端标记6-FAM荧光，用于后期PCR产物的毛细 管电泳。(表2)表2应用于SMA产前诊断STR连锁分析的单一 STR PCR引物信息表中F表示PCR中所用正向引物，R表示PCR中所用反向引物。
2.单一 STR PCR反应20ul PCR体中包括基因组DNA 2. 5 5ng/ul，正反向引 物各0. 2uM，0. 25mM dNTPs (购自大连宝生物公司)，1. 875mM Mg2+ (购自大连宝生物公司)， IXGold Buffer (购自美国 ABI 公司)，IM Betaine (购自美国 Promega 公司)，0. 05U/ul Gold Taq聚合酶(购自美国ABI公司)，置于东胜龙PCR仪(北京东胜创新公司)进行反应。PCR 反应程序为95°C 预变性 8min ;95°C 30s, 59°C 30s, 72°C 60s, 35 个循环；72°C IOmin, 4°C保存。PCR产物使用3730DNA分析仪(美国ABI公司)进行毛细管电泳后，经GeneMapper 软件分析PCR产物片段长度。同一 STR位点不同的PCR产物长度可判断为不同的等位基因 型，根据PCR产物的长度进行STR分型与家系连锁分析。该例家系经过MLEPA的STR连锁分析后，胎儿STR基因型与家系中的先证者相同， 可判断确定其胎儿为SMA受累患者(图2)。这一结果与常规的单一 STR PCR的联锁分析结 果完全相同(图3)。通过该例SMA产前诊断的STR连锁分析实践，说明MLEPA完全可以准 确迅速的完成STR分型，并应用于连锁分析中。SMA产前诊断的STR连锁分析中，使用MLEPA技术仅需对待检家系进行4次PCR反 应既可，而产生同样效果的单一 STR PCR需要进行20次PCR反应。通过该家系的SMA产前 诊断STR连锁分析实践可见，MLEPA技术进行STR分析结果简便、可靠(与目前广泛使用的 单一 STR PCR结果完全一致)。通过MLEPA的方法，能够简化STR连锁分析的实验步骤，使 得STR位点的应用与研究更加快捷、迅速。具体实施例2 =MLEPA应用于保守DNA位点拷贝数的检测--性染色体倍性的
MLEPA检测MLEPA不仅能够检测具有长度多态性的STR位点，同时，类似MLPA，也能进行保守 DNA位点的拷贝数检测。为了检测样本的性染色体倍性情况，针对X染色体特异保守的AR基因，Y染色体 特异保守的SRY基因和13号染色体特异保守的BRCA2基因设计MLEPA探针，并配制成为性 染色体倍性检测的MLEPA探针组，建立性染色体倍性的MLEPA检测方法，并应用于核型已知 的性染色体倍性不同的样本中，验证其可靠性。3例实验样本均经过染色体G显带分析，核型已知。其中1号样本为正常女性，核 型为46，XX ；2号样本为正常男性，G显带核型为46，XY ；3号样本为核型异常男性，核型为Y 染色体等臂双着丝粒染色体，46，X，idic(Y) (pll.3)。这3例样本的X、Y染色体与13号染 色体剂量比例的理论值分别为2 O 2，1 1 2和1 2 2。3例样本来源均为外 周血2ml，EDTA抗凝。使用TOPure 血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA (上海基因科技公 司)。提取的基因组DNA样本溶于TE中，调节至浓度50 lOOng/ul待用。MLEPA实验分析方法探针组与通用引物的设计与制作针对3个待检的基因位点(AR基因，SRY基因 和BRCA2基因)设计MLEPA探针，设计原则如前所述(已设计探针均由上海生工合成)，其 中右探针5’端均进行磷酸化。将5对设计好的MLEPA探针混合至终浓度2 5nM，溶于TE 中，制作成为MLEPA探针组混合液。设计合成通用引物X与Y，其中通用引物X于5’端标记 6-FAM荧光标记，用于后期PCR产物的毛细管电泳。(表3)表3应用于性染色体倍性检测的MLEPA探针与通用引 物信息表中L表示MLEPA左探针，R表示MLEPA右探针。 1. MLEPA反应:MLEPA反应杂交步骤，延伸与连接步骤所用的反应缓冲液以及连接 酶Ligase-65均购自MRC-Holland公司(阿姆斯特丹，荷兰)。1)杂交步骤5ul DNA样本98°C5min预变性，接着冷却至25°C，加入1. 5ul的MLPA buffer与1. 5ul的MLEPA探针组混合液，95°C 2min后于60V杂交16个小时。2)延伸与连接步骤8ul杂交过夜的样本中加入32ul延伸与连接混合液(延伸 与连接混合液由 3ul Ligase-65Buffer A，3ul Ligase-65Buffer B, Iul IOmM dNTPs, Iul Ligase-65连接酶，0. 2ul r-Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司)和23. 8ul ddH20组成)， 54°C反应20min后，98°C 5min终止反应，得到40ul MLEPA延伸与连接产物。3)PCR反应25ul PCR体系包括5ul MLEPA延伸与连接产物，0. 5ul IOuM的通用弓丨 物 X 与 Y, 12. 5ul 的 2XPremix Taq Hot Start Version (购自大连宝生物公司)和 6. 5ul ddH20。置于东胜龙PCR仪(北京东胜创新公司)进行反应。PCR反应程序为98°C预变性 3min ；95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C 20min，4°C保存。4) PCR产物使用3730DNA分析仪(美国ABI公司)进行毛细管电泳后，经 GeneMapper软件分析PCR产物片段长度及相应片段电泳荧光峰值(F)。2.拷贝数分析计算方法3个样本中，设其中2号样本(正常男性)为正常参照 样本R，其余两样本为待检样本Τη，η = 1，2，其中1号样本为T1, 3号样本为T2。AR，SRY和 BRCA2三个检测位点的荧光值为Α，S和B。参照样本R的三个检测位点荧光值分别为RA，Rs 和Rb ；待检样本Tn三个检测位点的荧光值为TnA，Tns和TnB。
1)探针归一化由于参照样本R为正常男性样本，其X染色体Y染色体13号 染色体的理论剂量比为1 1 2。因此，对待检样本的检测位点荧光值按如下公式归一 化，归一化后的值为Τη’ Α，Τη’ s和Τη’ Β Τη，Α = TnAXRsXRBΤη，s = TnsXRaXRb Τη，Β = 2XΤηΒXRaXRs2)待检样本染色体拷贝数分析待检样本MLEPA检测所得X染色体Y染色 体13号染色体的剂量比按如下公式计算X染色体拷贝数Y染色体拷贝数13号染色体拷贝数=Τη’ Α Τη’ s Τη’ B这3个样本经MLEPA分析后，结果峰图如图4所示。其荧光峰值数据见表4。表4三个样本MLEPA产物毛细管电泳结果 BRCA2 Chr 1317090241759010981以2号样本(正常男性)为正常参照样本R，计算其余两个样本的X染色体Y染 色体13号染色体的剂量比，MLEPA分析结果为1号样本的X染色体拷贝数Y染色体拷贝数13号染色体拷贝数= 1.96 0 23号样本的X染色体拷贝数Y染色体拷贝数13号染色体拷贝数= 0.89 1.82 2这一结果，与1号样本和3号样本的X、Y染色体与13号染色体剂量理论比例十分 接近。这说明，MLEPA也可应用于特异保守的DNA序列检测，并能够完成靶序列的拷贝数检 验，其结果也是可靠的。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤(1)DNA靶序列变性并与MLEPA探针进行杂交；(2)延伸与连接反应；(3)PCR反应；(4)PCR产物通过毛细管电泳分离；(5)电泳结果进行数据处理；所述的延伸与连接反应是同时使用DNA多聚酶与连接酶的延伸与连接反应。
2.根据权利要求1所述的方法，方法步骤(1)中所述的MLEPA探针是根据DNA靶序列 设计的寡核苷酸左探针和寡核苷酸右探针，左探针的5’端为通用引物X区，3’端为其与靶 序列的杂交区，右探针的5’端为其与靶序列的杂交区，3’端为通用引物Y的互补区，其特征 在于，寡核苷酸左探针和寡核苷酸右探针的杂交区在DNA靶序列上有一段间隔序列，若待 检位点为具有长度多态性的DNA位点，则将具有长度多态性的DNA序列置于该间隔序列中， 通过后续的反应检测该间隔序列中的待检位点的重复情况与长度多态性，若待检位点为保 守DNA位点，则通过间隔序列的长度调整调节最终PCR产物长度并通过后续电泳检验相应 位点。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的待检DNA位点可以是具有长度多态 性的STR位点。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的待检DNA位点也可为不具长度多态 性的保守DNA位点。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的STR位点选择是D5S112、D5S435、 D5S557、D5S351 和 D5S610。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的保守DNA位点选择是AR基因，SRY 基因和BRCA2基因。
7.—种能够同时扩增与检测多个位点试剂盒，包括寡核苷酸左探针、寡核苷酸右探针、 DNA多聚酶、连接酶，其特征在于，所述的试剂盒还包括多重连接与延伸依赖探针扩增方法 的探针组，所述的探针组中至少有两对根据待检位点设计的探针。
全文摘要
本发明涉及一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法，所述的方法包括如下步骤(1)DNA靶序列变性并与MLEPA探针进行杂交；(2)延伸与连接反应；(3)PCR反应；(4)PCR产物通过毛细管电泳分离；(5)电泳结果进行数据处理；所述的延伸与连接反应是同时使用DNA多聚酶与连接酶的延伸与连接反应。本发明还提供了一种能够同时扩增与检测多个DNA位点试剂盒。本发明的有益效果是可以在一次反应中同时进行多个DNA位点的检测。由于其探针设计的灵活，MLEPA技术可被灵活广泛的应用到各类型STR位点与保守DNA位点的检测中。
文档编号C12Q1/68GK101845502SQ201010183920
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日 公开号201010183920.发明者周华, 孙维, 陈炜, 陶炯 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院