用于基因甲基化检测的引物和探针、采样方法、试剂盒与流程

文档序号:11246442阅读:3078来源:国知局
用于基因甲基化检测的引物和探针、采样方法、试剂盒与流程

本发明属于基因检测领域,更具体地,是一种用于基因甲基化检测的引物和探针、采样方法、试剂盒。



背景技术:

dna甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。基因启动子高甲基化以后基因表达就会减弱甚至关闭,相当于基因的开关。恶性肿瘤中基因的开关多由dna甲基化调控,几乎所有肿瘤中都会伴随dna甲基化的异常改变,且常常高甲基化与低甲基化并存。如肿瘤细胞中抑癌基因启动子通常为高甲基化,导致抑癌基因表达受抑制丧失抑癌功能,从而促进癌症的发生。低甲基化通常是整个基因组低甲基化或原癌基因启动子低甲基化,前者导致染色体结构稳定性降低,促进癌变发生,后者则会激活原癌基因,诱导细胞癌变。

sept9基因的v2转录本启动子甲基化已被证实与crc(结直肠癌)的发生密切相关,甲基化导致基因转录受到抑制,从而影响基因的正常表达,并使其抑癌功能丧失,影响囊泡运输、丝状结构形成、细胞分裂和凋亡等功能。大量临床研究证实,不同于正常结直肠组织,crc组织中可检出明显异常的sept9基因甲基化,sept9基因甲基化是crc早期发生、发展过程中的特异性分子标记物。sept9甲基化检测可检出70%以上的早期结直肠患者,可大大降低结直肠癌患者的死亡率。2016年4月美国fda(美国食品药物管理局)已经批准该项检查应用于临床。

dna甲基化的检测大体分为两个步骤:1.待检测样品的前期处理;2.目标序列的定位和甲基化状态的量化。dna甲基化预处理方式主要分为三种:1.限制性内切酶法;2.蛋白或抗体富集;3重亚硫酸盐转化法。以重亚硫酸盐预处理法应用最为广泛。dna经亚硫酸氢钠预处理后,非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,对其进行pcr扩增的话进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢钠影响,保持不变。这样dna片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的差异。通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶是否甲基化。

目前检测特异性位点的甲基化的方法主要有以下几种:

(1)结合重亚硫酸盐的直接测序法(bisulfitesequencing,bsp)

该方法首先用重亚硫酸盐使dna中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变;用pcr扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,最后,对pcr产物进行克隆测序并且与未经处理的序列比较,判断是否cpg位点发生甲基化。此方法是精确度很高,能明确目的片段中每一个cpg位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,不易大批量操作,过程较为繁琐、昂贵。

(2)甲基化特异性的pcr(methylation-specificpcr,ms-pcr)

该方法先将dna重亚硫酸盐处理,随后进行引物特异性的pcr。其设计两对引物,分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对,即一对结合处理后的甲基化dna链,另一对结合处理后的非甲基化dna链。电泳检测ms-pcr扩增产物,如果用针对处理后甲基化dna链的引物能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;反之亦然。这种方法引物设计至关重要,设计不好容易有假阳性;只能做定性研究,即只能明确是否存在甲基化。且需电泳分离检测,容易污染。

(3)甲基化荧光法(methylight)

结合重亚硫酸盐处理待测dna片段,设计一个能与待测位点区互补的探针,探针的5′端连接报告荧光,3′端连接淬灭荧光,随后行实时定量pcr。如果探针能够与dna杂交,则在pcr用引物延伸时,taqdna聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下,淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制,这样报告荧光发光,测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。本方法高效,迅速,具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点。缺点是测定每个位点需要一对引物和标有荧光素的探针,探针无法检出杂合甲基化,只适用于少数位点大量样本筛查。

(4)甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析(methylation-sensitivehigh-resolutionmelting,ms-hrm)

亚硫酸氢盐处理后,甲基化与未甲基化dna会存在序列差异,这种差异可通过熔解曲线分析来发现,因为甲基化dna含有更多的gc,相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化,可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(hrm)技术可检出极微小的差别。

使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物,相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高,需要带hrm模块的荧光定量pcr仪。利用ms-hrm技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析,并不能明确每个cpg位点的甲基化状态。并且该方法使用的是染料,只能检测一个荧光信号通道。

(5)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

epitypertmdna甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和maldi-tof检测原理,可实现多重cpg的分析检测。massarray甲基化检测无需任何荧光标记,每个反应覆盖长达500bp的多个cpg位点,且灵敏度高,可检测低至5%的甲基化水平,但仪器较为昂贵,不适合临床应用。

临床应用较多的检测基因甲基化的方法主要为甲基化荧光法,但这种方法的引物探针的设计都是针对单链,而基因组的序列经过重亚硫酸盐转化后,正链和反链已经不再相互配对,基本上相当于不同的两条链。加入同样的浓度的样本,正反链同时检测可以比只进行单链检测的样本量增加一倍。肿瘤的发生、发展是一个极为复杂的过程,肿瘤细胞具有明显的异质性特征。不同的肿瘤细胞处于不同的发育阶段,所以正反链的甲基化程度不一定一致。只检测正链或者只检测反链会导致检测的灵敏度不足。特别是dna含量少的样本如血浆样本。

因此分别针对重亚硫酸盐转化后的正链和反链设计引物,同时进行检测,更全面有效地检测基因的甲基化状态,提高检测的灵敏度。



技术实现要素:

本发明主要解决的技术问题是提供用于甲基化基因检测的引物、探针及方法,本发明具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点,检测结果具有较好的准确性和重复性、能有效提高基因甲基化检测情况,适用于临床。

一种用于基因甲基化检测的引物和探针,其中,引物包括特异性甲基化正链引物和特异性甲基化反链引物;特异性甲基化正链引物包括正链正向引物和正链反向引物,特异性甲基化反链引物包括反链正向引物和反链反向引物;

探针包括特异性甲基化正链探针和特异性甲基化反链探针;

具体为:

正链正向引物:gattcgttgtttattagttattatgt

正链反向引物:aaataatcccatccaacta

特异性甲基化正链探针:ttaaccgcgaaatccgac

反链正向引物:tagtaatttattttgttagtttagt

反链反向引物:catcatatcccaccaac

特异性甲基化反链探针:aattcgcgtataccgtcat。

进一步说,本发明所述的一种用于基因甲基化检测的引物和探针,还设有正链非甲基化封闭引物和反链非甲基化封闭引物;具体为:

正链非甲基化封闭引物:gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反链非甲基化封闭引物:catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac。

进一步说,在本发明中,正链非甲基化封闭引物和反链非甲基化封闭引物用磷酸化、间臂、mgb或pna中的一种修饰或多种修饰。

进一步说,在本发明中,探针为taqman探针;荧光标记可以为fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一种或多种;淬灭基团可以为tamra、bhq1或eclipse中的一种或多种。

采用本发明所述用于基因甲基化检测的引物和探针的用途,用于检测结直肠癌的sept9基因甲基化的正链和反链相关序列。

采用本发明所述用于基因甲基化的检测方法,按如下步骤进行:获取待测样本;对待测样本进行重亚硫酸盐处理;将经过重亚硫酸盐处理后的样本,使用荧光定量pcr法同时检测基因甲基化的正反链,其中包括特异性甲基化正链引物和特异性甲基化反链引物。

采用本发明所述用于基因甲基化检测的引物和探针的试剂盒,包含一种或者多种内参基因序列;内参基因序列为:

actb正向引物:taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物:cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探针:aaatacacacaaacaccca

alu正向引物:ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物:attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探针:cctaccttaacctccc

gapdh正向引物:ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物:aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探针:ctaacctttaaaatcaaat。

本发明技术方案带来的有益效果

甲基化荧光法和其他的甲基化基因检测方法相比具有操作简单,实验时间短。闭管反应,减少污染的机率,结果判断明确客观,适用于临床。而本发明在甲基化荧光法的基础上同时检测甲基化的正反链,更全面有效地检测基因的甲基化状态,提高了检测的灵敏度,特异适用于dna含量少的样本如血浆、血清类样本的检测

附图说明

图1是sept9基因甲基化双链检测和单链检测分析性能比较。

图2是sept9基因甲基化双链检测和单链检测荧光曲线图。

具体实施方式

现结合附图详细说明本发明的技术细节。

用于基因甲基化检测的引物和探针,引物包括特异性甲基化正链引物和特异性甲基化反链引物;特异性甲基化正链引物包括正链正向引物,一条选自a组和正链反向引物,一条选自b组,特异性甲基化反链引物包括反链正向引物,一条选自c组和反链反向引物,一条选自d组;

探针包括特异性甲基化正链探针,一条选自e组和特异性甲基化反链探针,一条选自f组;

具体为:

a组:正链正向引物:

gattcgttgtttattagttattatgt

ttcattcagctgagccaggg

gaaggtgggtgttgggtt

b组:正链反向引物:

aaataatcccatccaacta

gggcagcggcgaggaa

cccgtcccgcgccaaa

e组:特异性甲基化正链探针:

ttaaccgcgaaatccgac

tccggcggctagctctgcac

tcgcggacgtgttggaga

c组:反链正向引物:

tagtaatttattttgttagtttagt

tatttagttgcgcgttgatc

agagttagtcgtcggaggag

d组:反链反向引物:

catcatatcccaccaac

ctcctccgacgactaactct

atacgaatacgaaaacctaatc

f组:特异性甲基化反链探针:

aattcgcgtataccgtcat

gtagcgggtcgcgcggagggt

ttttttcgcgcgttgcgttttc。

进一步说,设有正链非甲基化封闭引物,一条选自g组和反链非甲基化封闭引物,一条选自h组;具体为:

g组:正链非甲基化封闭引物:

gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

gagttagggggtttaggggtttttttggtggtt

ggttgttgcggtcgcggacgtgttggagaggattt

h组:反链非甲基化封闭引物:

catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

gttgattgtggggtttgatatgatggttggtgggta

gaggagtttttaggttttttggtttagttgaatga。

进一步说,正链非甲基化封闭引物和反链非甲基化封闭引物用磷酸化、间臂、mgb或pna中的一种修饰或多种修饰。

进一步说,探针为taqman探针;所述的荧光标记可以为fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一种或多种;淬灭基团可以为tamra、bhq1或eclipse中的一种或多种。

进一步说,用于检测结直肠癌的sept9基因甲基化的正链和反链相关序列。

进一步说,按如下步骤进行:获取待测样本;对待测样本进行重亚硫酸盐处理;将经过重亚硫酸盐处理后的样本,使用荧光定量pcr法同时检测基因甲基化的正反链,其中包括特异性甲基化正链引物和特异性甲基化反链引物。

进一步说,包含一种或者多种内参基因;所述内参基因为actb,alu,gapdh等管家基因中的一种或者多种;内参基因序列为:

actb正向引物:taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物:cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探针:aaatacacacaaacaccca

alu正向引物:ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物:attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探针:cctaccttaacctccc

gapdh正向引物:ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物:aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探针:ctaacctttaaaatcaaat。

实施例1

重亚硫酸盐处理后胞嘧啶转化为尿嘧啶,5-甲基胞嘧啶(5-mc)保持不变;再经pcr扩增,u转化为胸腺嘧啶(t),而5-mc重新恢复为c。研究发现sept9基因的v2启动子区:在结直肠癌的组织样本中,该区域内的碱基序列甲基化水平最高;而在正常人群或患有其它疾病的人群中,该区域内的碱基序列甲基化水平最低。因此,检测该区域内dna的甲基化水平能够有效地进行结直肠癌的诊断。

sept9dna的v2启动子区的正链核苷酸序列如下所示:

gacccgctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcattt。

其互补链(反链)的核苷酸序列如下所示:

aaatgatcccatccagctgcgcgttgaccgcggggtccgacatgatggctggtgggcagcgggtc。

全甲基化的样本正链重亚硫酸盐转化后的核苷酸序列如下所示:

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt。全甲基化的样本互补链(反链)重亚硫酸盐转化后的核苷酸序列如下所示:

aaatgattttatttagttgcgcgttgatcgcggggttcgatatgatggttggtgggtagcgggtc

全甲基化样本重亚硫酸盐转化后的正链核苷酸序列和其互补链(反链)的核苷酸序列并不是完全互补配对的,有44.6%的碱基序列不是互补配对的。具体如下所示,“|”标示的是可以互补配对,“.”标示的是不可以互补配对的。

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt

||..||.|....|..|...||.||.|||.|...||||.|.||||||.|..|..||...||.||||

ctgggcgatgggtggttggtagtatagcttggggcgctagttgcgcgttgatttattttagtaaa

因此针对重亚硫酸盐转化后的正反链同时设计引物,探针,封闭引物;同时对两条链进行检测,可以更全面有效地检测基因的甲基化状态,提高检测的灵敏度。在对经亚硫酸氢盐处理的sept9dna进行pcr扩增的退火过程中,封闭引物优先于引物对和探针特异性结合到未甲基化的sept9dna上,并阻止引物对,探针与未甲基化的sept9dna结合的核苷酸序列。

1、采用的探针和引物(引物探针跟权力要求一样进行更改)

sept9的引物探针序列:

正链正向引物:gattcgttgtttattagttattatgt

正链反向引物:aaataatcccatccaacta

正链探针:ttaaccgcgaaatccgac

正链封闭引物:gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反链正向引物:gtagtagttagtttagtatttatttt

反链反向引物:cccaccaaccatcatat

反链探针:aattcgcgtataccgtcat

反链封闭引物:catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

封闭引物可以用磷酸化,间臂,mgb,pna等一种修饰或多种修饰。

探针为taqman探针,荧光标记可以为fam,vic/joe,ned/tamra/cy3,rox/texasred和cy5中的一种或多种。淬灭基团可以为tamra,bhq1,eclipse中的一种或多种。

2、模板dna的制备:甲基化人类基因组dna,非甲基化人类基因组dna。

3、pcr检测体系:共配制两个荧光pcr体系,其中第一个反应体系只使用正链引物、探针及封闭引物;第二个反应体系同时使用正反链引物、探针及封闭引物。

30ulpcr反应体系中包含:1*probepremix、septin9基因引物各0.5μmol、septin9基因荧光探针各0.2μmol、septin9基因封闭引物1μmol和5ul模板dna,其他用水补充。

配置好pcr反应体系,将二倍稀释的20pg/ul~1.25pg/ul的甲基化人类基因组dna、非甲基化人类基因组dna和无模板对照加入pcr管中进行检测。

pcr扩增反应的具体过程为:92~97℃预变性5~35分钟,再进行聚合酶链式反应扩增阶段,92~97℃变性10~30s,50~65℃退火10~30s,并进行35~55个循环。

4、结果分析:对无模板对照(ntc)的扩增曲线进行分析,septin9应无扩增信号,说明实验无污染,可以继续分析。

5、结果

图1是sept9基因单链检测和双链检测的pcr体系检测不同浓度的完全甲基化的基因组dna样本,同一浓度重复检测12次。参见图1显示的结果,双链同时检测的灵敏度提高,对于浓度为1.25pg/ul的样本提高了100%的检测重复率。

图2是sept9基因单链检测和双链检测的pcr体系检测同样样本荧光曲线图。由图2可知同样的样本,双链同时检测比单链检测的pcr荧光强度高,ct值提前。

上述的实验结果表明,同时对正反链进行扩增,能够有效提高sept9甲基化基因检测情况。

实施例2

甲基化sept9基因检测试剂盒在结直肠癌样本检测中的应用

sept9基因甲基化是crc早期发生、发展过程中的特异性分子标记物。sept9甲基化检测可检出70%以上的早期结直肠患者。采用本发明中对重亚硫酸盐转化后的sept9基因正反链同时进行扩增,可以开发出针对sept9基因甲基化检测的试剂盒,可以快速,灵敏地检测样本中sept9基因的甲基化状态。在试剂盒中还可以加入actb基因等内对照,用于监控检测结果。

1、sept9的引物探针序列:(引物探针跟权力要求一样进行更改)

正链正向引物:gattcgttgtttattagttattatgt

正链反向引物:aaataatcccatccaacta

正链探针:ttaaccgcgaaatccgac

正链block:gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反链正向引物:gtagtagttagtttagtatttatttt

反链反向引物:cccaccaaccatcatat

反链探针:aattcgcgtataccgtcat

反链block:catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

block可以用磷酸化,间臂,mgb,pna等一种修饰或多种修饰。

探针为taqman探针,荧光标记可以为fam,vic/joe,ned/tamra/cy3,rox/texasred和cy5中的一种或多种。淬灭基团可以为tamra,bhq1,eclipse中的一种或多种。

2、内参引物和探针序列

actb正向引物:taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物:cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探针:aaatacacacaaacaccca

alu正向引物:ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物:attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探针:cctaccttaacctccc

gapdh正向引物:ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物:aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探针:ctaacctttaaaatcaaat

内参基因为actb,alu,gapdh等管家基因中的一种或者多种。

3、样本:待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。所述阳性质控品全甲基化人类基因组dna,所述阴性质控品为非甲基化人类基因组dna。

4、仪器:abi7500、nanodrop2000、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。

5、试剂:游离dna提取试剂盒(苏州海狸)、重亚硫酸盐转化试剂盒(zymo)、probepremix(takara)、纯化水。

6、游离dna提取:使用苏州海狸提取试剂盒。详细步骤见该产品说明书。

7、重亚硫酸盐转化:使用zymo重亚硫酸盐转化试剂盒。详细步骤见该产品说明书。

8、pcr反应体系:

30ulpcr反应体系中包含:1*probepremix、septin9基因正反链上下游引物各0.5μmol、septin9基因正反链荧光探针各0.2μmol、septin9基因正反链封闭引物1μmol、内参上下游引物、荧光探针各0.3μmol和5ul模板dna。配置好pcr反应体系,将待测dna样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照加入pcr管中进行检测。

9、pcr扩增反应的具体过程为:92~97℃预变性5~35分钟,再进行聚合酶链式反应扩增阶段,92~97℃变性10~30s,50~65℃退火10~30s,并进行35~55个循环。

10、结果分析:

对无模板对照(ntc)的扩增曲线进行分析,septin9和内参基因应无扩增信号,说明实验无污染,可以继续分析。

阴阳性质控品的内参基因应均有扩增信号,且呈s型扩增曲线,阴阳性质控品内参基因的ct值应该≤32;阴性质控品的septin9应无明显扩增信号,阳性质控品septin9的ct值应≤32。质控品检测满足以上条件时,证明实验有效,可继续分析。

样本的内参基因应均有扩增信号,且呈s型扩增曲线,且ct值应该≤32,实验结果才有效。此时样本的septin9的ct值<45,则判断为阳性;样本的septin9没有扩增信号,则判断为阴性。

若不满足无模板对照及阴阳性质控品的要求,则建议重新检测。

11、结果,在50例结直肠癌血浆样本中,对sept9正反链同时进行检测的试剂盒共检测到sept9基因甲基化阳性48例,阳性率为96%;而只对sept9正链进行检测的试剂盒共检测到sept9基因甲基化阳性45例,阳性率为90%。在50例健康人血浆样本中,不管是对sept9正反链检测还是只对sept9正链进行检测的检测结果都为sept9基因甲基化阴性。

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