转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒与流程

技术领域：

本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒。

背景技术：
：

目前上市的转基因甜菜品系共有三个：gtsb77、t120-7和h7-1，其中h7-1已获得我国农业部批准用于饲料。转基因甜菜gtsb77是由诺华公司和孟山都公司通过农杆菌介导法将导入甜菜，研发出具抗草甘膦除草剂抗性的甜菜品系，商品名为：invigor^tmsugarbeet。1998年-2004年间，美国、日本、加拿大、澳大利亚、菲律宾相继批准甜菜gtsb77品系作为食品或饲料用途，中国尚未批准转基因甜菜gtsb77批准用于食品和饲料。目前美国和加拿大95％以上种植的甜菜均为转基因甜菜。

gtsb77(glyphosate-tolerantsugarbeetline77)由转入三个基因研发而成：cp4-epsps基因、uida基因和修饰过的gox基因。cp4-epsps基因和gox基因均为草甘膦除草剂耐受基因(cp4-epsps基因编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶对草甘膦除草剂不敏感；gox基因编码草甘膦氧化还原酶而降解除草剂，然而由于其在翻译过程中被截断，其序列69％与甜菜基因融合形成嵌合基因，尽管嵌合基因序列能进行mrna转录，但没有新的蛋白翻译产生，因此转基因甜菜gtsb77没有gox酶活性。)。

目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。品系特异性pcr(转化事件特异性)(event-specificpcr)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选pcr(screeningpcr)、基因特异性pcr(gene-specificpcr)、构建特异性pcr(construct-specificpcr)具有更加高的具有高特异性，甚至能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。

为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因甜菜gtsb77品系特异性定量pcr精准检测方法十分必要。目前欧盟等其他国家和地区均尚无转基因甜菜gtsb77品系特异性定量检测方法。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因甜菜gtsb77品系的转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

gtsb77-f：5’-aacgtggataccacatcgtgatc-3’(如seqidno.1所示)；

gtsb77-r：5’-gaagtccaaatcagccgaaattt-3’(如seqidno.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：

gtsb77-p：5’-cccagaagctgctccacgtattccaa-3’(如seqidno.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

所述的荧光报告基团优选为fam，所述的荧光淬灭基团优选为bhq1。

本发明的第三个目的是提供一种转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测试剂盒，包括实时荧光定量pcr反应液、耐热dna聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

gtsb77-f：5’-aacgtggataccacatcgtgatc-3’(如seqidno.1所示)；

gtsb77-r：5’-gaagtccaaatcagccgaaattt-3’(如seqidno.2所示)；

所述的检测探针如下所示：

gtsb77-p：5’-cccagaagctgctccacgtattccaa-3’(如seqidno.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

本发明的第四个目的是提供一种转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品的基因组dna作为模板；

(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系；

(3)将扩增反应体系在荧光pcp仪上进行实时荧光pcr反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜gtsb77品系。

优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l检测引物gtsb77-f和gtsb77-r各0.5μl，10μmol/l检测探针gtsb77-p0.5μl，dna模板2μl和ddh2o8.8μl；所述的步骤(3)的实时荧光pcr反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜gtsb77品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因甜菜gtsb77品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因甜菜gtsb77品系。

本发明的第五个目的是提供一种转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取转基因甜菜gtsb77品系的基因组dna进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应；

(2)反应后得到各起始浓度模板对应的ct值，该ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因甜菜gtsb77品系的标准曲线；

(3)提取待测样品的基因组dna为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcp仪上进行实时荧光pcr反应，反应后得到ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因甜菜gtsb77品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因甜菜gtsb77品系基因组dna的含量(拷贝数或质量)。

本发明针对转基因甜菜gtsb77品系特异性序列(gtsb77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列)设计引物和taqman探针，建立转基因甜菜gtsb77实时荧光聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现其定量检测下限为16拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(r²)为0.99，扩增效率e为101％，重复性实验显示本方法的标准偏差(sd)及相对标准偏差(rsd)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足监管部门和公众对转基因甜菜gtsb77进行品系特异性检测鉴定的需求。

附图说明：

图1是甜菜内源基因gs特异性扩增图，1～4分别为gs-gtsb77质粒、转基因甜菜h7-1、非转基因甜菜荷兰kuhn8060和非转基因甜菜吉甜2045扩增曲线，阴性扩增分别为：转基因油菜mon88302、转基因苜蓿j101、转基因苜蓿j163、转基因玉米mon810、转基因大豆gts40-30-2、转基因玉米bt11、转基因玉米mir162、转基因玉米nk603、非转基因大麦、非转基因玉米和非转基因大豆、阴性对照和空白对照。

图2是转基因甜菜gtsb77品系特异性检测方法特异性实验结果，1为gs-gtsb77质粒；2～17分别为：转基因油菜mon88302、转基因苜蓿j101、转基因苜蓿j163、转基因玉米mon810、转基因大豆gts40-30-2、转基因玉米bt11、转基因玉米mir162、转基因玉米nk603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰kuhn8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜h7-1、非转基因玉米和非转基因大豆、阴性对照和空白对照。

图3是转基因甜菜gtsb77品系特异性检测灵敏度试验扩增图；1～8分别为：800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl质粒dna。

图4是实时荧光pcr检测甜菜内源基因gs的标准曲线，quantity表示dna模板量(拷贝数)。

图5是实时荧光pcr检测转基因甜菜gtsb77品系的标准曲线，quantity表示dna模板量(拷贝数)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

主要材料：转基因油菜mon88302、转基因苜蓿j101、转基因苜蓿j163、转基因玉米mon810、转基因大豆gts40-30-2、转基因玉米bt11、转基因玉米mir162、转基因玉米nk603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰kuhn8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜h7-1、非转基因玉米和非转基因大豆为本实验室购置储备，甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)和转基因甜菜gtsb77品系特异性片段双基因阳性质粒(双基因阳性质粒为将内源基因gs基因片段160bp序列(如seqidno.4所示)和转基因甜菜gtsb77品系特异性片段379bp序列(如seqidno.5所示)共539bp序列(如seqidno.6所示)克隆到ampr抗性的puc57载体上构建得到的重组质粒，将重组质粒转入受体菌dh5a后-70℃保存。以下称gs-gtsb77质粒)为本实验室构建。

选择甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)(参考文献：mazzaram,fotin,savinic,vandeneedeg.event-specificmethodforthequantitationofsugarbeetlineh7-1usingreal-timepcr-validationreportandprotocol.eur22134en.2006.jrc32190)引物gs-f/r和探针gs-p用于检测甜菜样品基因组dna是否成功提取以及是否适于进行实时荧光pcr扩增；其序列信息详见表1。

主要试剂：primexextaq(2×)forqpcr，大连宝生物；dna提取试剂盒，北京天根公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10μm的工作液使用。

主要仪器与设备：

abi7500，abi7500fast实时荧光定量pcr仪，美国应用生物系统公司；qx200微滴式数字pcr系统，美国伯乐公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国thermo公司；研磨机，德国ika。

农作物材料样品基因组dna采用常规方法提取与纯化。

实施例1：实时荧光pcr检测方法的建立

根据转基因甜菜gtsb77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列(转基因甜菜gtsb77品系特异性片段，如seqidno.5所示)，应用primerprimer5.0软件设计引物和探针。将设计的引物、探针经ncbi网站上使用blast数据库比对确定引物和探针的理论特异性；甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)，用于甜菜来源样品dna的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1。

表1实时荧光pcr的引物、探针

扩增反应体系为25μl：包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l上游引物和下游引物各0.5μl，10μmol/l检测探针0.5μl，dna模板2μl和ddh2o8.8μl；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

实施例2：实时荧光pcr方法特异性测试

采用转基因油菜mon88302、转基因苜蓿j101、转基因苜蓿j163、转基因玉米mon810、转基因大豆gts40-30-2、转基因玉米bt11、转基因玉米mir162、转基因玉米nk603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰kuhn8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜h7-1、非转基因玉米和非转基因大豆的基因组dna为模板，阳性样品为gs-gtsb77质粒，阴性对照为非转基因大米dna。对建立的实时荧光pcr检测方法的特异性进行测试。实时荧光pcr检测反应体系和反应程序同实施例1。

结果显示，采用引物gs-f/r和探针gs-p对所有提取的样品的dna进行实时荧光pcr时，只有非转基因甜菜荷兰kuhn8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜h7-1和gs-gtsb77质粒来源的dna模板出现扩增曲线，其他农作物无典型扩增曲线，表明甜菜内源基因gs扩增结果正确(图1)。

采用gtsb77品系特异性引物gtsb77-f/r和探针gtsb77-p对所有提取的样品的dna进行实时荧光pcr时，只有阳性样品gs-gtsb77质粒的dna模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料dna为模板的均无典型荧光扩增曲线(图2)。表明本发明的检测方法特异性良好。

实施例3：灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立

将提取的gs-gtsb77质粒dna溶液加te缓冲液分别稀释至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl作为dna模板进行转基因甜菜gtsb77实时荧光pcr检测，实时荧光pcr检测反应体系和反应程序同实施例1，进行灵敏度测试；测试结果显示(图3)，800000-8copies/μl范围内7个浓度梯度三个平行均能有典型扩增曲线，而到4copies/μl浓度只有一个平行有扩增曲线，显示其结果不稳定。所以最低检测浓度为8copies/μl。扩增图1-8分别为800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl扩增曲线。

将提取的gs-gtsb77质粒dna溶液加te缓冲液分别稀释至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl作为dna模板，进行转基因甜菜gtsb77实时荧光pcr检测，进行线性范围测试及可重复性测试，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光pcr检测反应体系和反应程序同实施例1。结果如表2所示。在模板量16-1600000copies(2μl/25μl体系)范围内7个浓度(其中4cpies/μl的浓度检测结果不稳定，三个平行只有一个ct值，故不列入线性范围计算)的对数值与所得ct值建立标准曲线(图5)，线性回归方程为：y＝-3.295x+40.385，r²为0.997，扩增效率为101％(介于90％～110％)，表明其线性相关性良好，扩增效率高，均符合engl相关要求[definitionofminimumperformancerequirementsforanalyticalmethodsofgmotesting]；在模板量为16-1600000copies的范围内，其ct值的sd介于0.02-0.61，rsd介于0.05％-1.64％，表明在最低模板量16copies时，其sd和rsd均小于25％。所以本发明的定量检测下限为16copies。实时荧光pcr检测甜菜内源基因gs的标准曲线见图4，线性方程为：y＝-3.292+41.06，r²:0.995，扩增效率101％，均满足相关要求。

表2实时荧光pcr方法的灵敏度及可重复性测试

本发明针对转基因甜菜gtsb77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列设计引物和探针，建立的转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测方法，可对转基因甜菜gtsb77进行品系特异性快速、高通量的定性及定量检测，满足检测、监管部门对其进行标识的需求。

序列表

<110>中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局

<120>转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒

<160>6

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aacgtggataccacatcgtgatc23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gaagtccaaatcagccgaaattt23

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccagaagctgctccacgtattccaa26

<210>4

<211>160

<212>dna

<213>甜菜

<400>4

cacgcatccaccccaccatgcatctctctctgtctcccacaggggagccaggatggcgta60

ctgagcctggatgacaatgactctcagcatctgcctccctacgggaactactaccagaac120

ctggggggcgatggcaacatcaggagaaactacgaactgt160

<210>5

<211>379

<212>dna

<213>转基因甜菜gtsb77

<400>5

cgtgttatcggattcgagactgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggt60

gttcttgctgttgatgcagctgttgttgcagctggtgcacactccaagtctcttgctaac120

tcccttggtgatgacatcccattggataccgaacgtggataccacatcgtgatcgccaac180

ccagaagctgctccacgtattccaactaccgatgcttctggaaagttccggtccaaattt240

gtttacattgtgtccaaatttcggctgatttggacttccctagctatgccaactaagcta300

ataaaaaacatgaaacaacaattacaaactgtcgagcacaccttctacaaactagcttag360

atttctattggaagttaca379

<210>6

<211>539

<212>dna

<213>gs-gtsb77质粒

<400>6

cacgcatccaccccaccatgcatctctctctgtctcccacaggggagccaggatggcgta60

ctgagcctggatgacaatgactctcagcatctgcctccctacgggaactactaccagaac120

ctggggggcgatggcaacatcaggagaaactacgaactgtcgtgttatcggattcgagac180

tgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggtgttcttgctgttgatgcagc240

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attacaaactgtcgagcacaccttctacaaactagcttagatttctattggaagttaca539