一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及脑卒中的辅助诊断
技术领域：
，特别涉及一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，尤其指一种能用于检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：脑卒中(cerebralstroke)是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床表现为严重头痛、昏厥、失去意识等，这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。脑卒中是一种由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，对脑卒中发病机制的探索进而寻找出适合诊断治疗药物已然成为了现今研究的一个热点。而在脑卒中的发病机制尚未清晰阐明的情况下，对脑卒中的预防以及早期检测更是刻不容缓。二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)是一种蛋白编码基因，它能够催化二氢叶酸转化为四氢叶酸。该蛋白的缺乏会导致同型半胱氨酸水平升高，进而提高脑卒中的患病风险。二氢叶酸还原酶是由位于第5号染色体的二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductasegene，dhfr)(chr5:79950220—79950350)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有着较大的关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究较少。目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、针对性强、检测准确率高的一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒；通过对样品dna甲基化水平测定辅助诊断脑卒中，检测方法简单、检测效率高。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-tatttgagcggtggttag-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-tctactataacgaacgaactc-3’。一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法：其特征是：包括以下步骤：步骤一、提取样本的全血基因组dna，并检测所得dna的浓度；步骤二、采用甲基化试剂盒对样本dna进行亚硫酸氢盐转化；步骤三、荧光定量实时特异性pcr前期准备：在引物含量为10um条件下，分别加入primerte或ddh2o进行稀释；步骤四、进行荧光定量实时特异性pcr：取步骤二中转化过的dna样本20ng加入到zymotaqtmpremix酶，并加入一对二氢叶酸还原酶启动子区甲基化特异性扩增引物，进行pcr扩增；步骤五、对结果进行甲基化程度分析。为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：上述的步骤一中采用lab-aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组dna，再通过nanodrop2000超微量分光光度计检测dna的浓度。上述的步骤二中采用ezdnamethylation-gold试剂盒对样本dna进行亚硫酸氢盐转化。上述的步骤四中pcr扩增条件为：首先95℃10min的预变性；接着95℃20s，tm20s，72℃30s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应40℃10min。本发明一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包含一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；通过检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度辅助诊断脑卒中，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于脑卒中的早期发现和及时治疗。其具有以下优点：1）高效、准确本产品采用荧光定量pcr技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性。2）方便、快捷本产品是基于血浆、唾液、尿液等体液检查的试剂盒，随时随地提取病人体液送检，并且能在较短时间内取得诊断结果。3）舒适、安全本产品采用非侵入式检测，告别入侵式的痛苦。同时，在检测过程中，对人体不存在任何的隐性或者显性的危险。4)经济、节约本产品相较于已有的诊断方式仅需较低的经济费用，易于为大众所接受，且避免了伦理侵犯问题。附图说明图1是被检测序列所在区域以及cpg位点的相关性示意图；图2是深圳地区病例组与对照组间的比较表图(表1)；图3是宁波地区病例组与对照组间的比较表图(表2)；图4是深圳与宁波地区病例组间的比较表图(表3)；图5是深圳与宁波地区对照组间的比较表图(表4)；图6是深圳与宁波地区各疾病组与对照组间的相关性比较表图(表5)。具体实施方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-tatttgagcggtggttag-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-tctactataacgaacgaactc-3’。一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法：其特征是：包括以下步骤：步骤一、采用lab-aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组dna，再通过nanodrop2000超微量分光光度计检测dna的浓度；全血基因组dna来自于被检测者的血浆、唾液、尿液等体液。步骤二、采用甲基化试剂盒对样本dna进行亚硫酸氢盐转化；全基因组dna中的胞嘧啶(c)与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶(t)，而单链中已发生甲基化的胞嘧啶则不转变为胸腺嘧啶。根据这一原理，通过使用zymoresearch公司的ezdnamethylation-gold试剂盒，经上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的dna。步骤三、荧光定量实时特异性pcr(qmsp)前期准备：在引物含量为10um条件下，分别加入primerte或ddh2o进行稀释。qmsp所需物质包括水、酶、引物、模板，其中、基因启动子区甲基化特异性扩增引物(含有上游引物和下游引物)已包括在本发明检测试剂盒之中，而引物在加样之前则需进行稀释。步骤四、进行荧光定量实时特异性pcr：1)取步骤二中转化过的dna样本20ng加入到zymotaqtmpremix酶，并加入一对二氢叶酸还原酶启动子区甲基化特异性扩增引物。最终体系中包含有水、酶、引物、模板。根据模板及引物的数量，合理设计加样顺序及内容。体系中各种成分的含量如下:试剂体积2xsybrgreeni5.00ulprimerf(10um)0.25ulprimerr(10um)0.25ulddh2o3.50ultemplate(diluted)1.00ul2）荧光定量pcr仪测定，1、先进行10分钟的预变性。2、完成45个pcr循环，分别为变性、退火与延伸3、获得溶解曲线。4、机器降温后读取结果。其设定程序见下表：步骤五、对结果进行甲基化程度分析。这里，运用相关软件(lightcycler®480_software)计算得出数据，整理统计。二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)是一种蛋白编码基因，它能够催化二氢叶酸转化为四氢叶酸。二氢叶酸还原酶基因启动子区域的高甲基化水平会导致该基因的低表达甚至表达沉默，导致具有辅酶活性的四氢叶酸下降引起同型半胱氨酸水平升高，进而成为脑卒中的一个极大的患病风险。因此，二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化水平与脑卒中的患病率呈正相关。本发明研制出一种以特异性检测脑卒中相关基因甲基化水平为基础，方便快捷地在分子水平上实现对脑卒中的检测的试剂盒，此种方法检测效率高，针对性强。下面通过实验证明二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化水平与脑卒中的患病率呈正相关。1、研究对象的收集从深圳和宁波地区的医院收集脑卒中患者样本，患者确诊采用“fast”判断法并结合最新式的仪器诊断技术后确定深圳地区脑卒中病人172例作为病例组(66.23±9.07岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的325名正常者作为对照组(66.00(60.00,72.00)岁)；收集宁波地区脑卒中病人56例作为病例组(62.98±11.70岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的137名正常者作为对照组(63.57±10.24岁)对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测尿酸水平、甘油三酯等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入edta抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组dna。2、基因组dna的提取应用lab-aid820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取上述步骤得到的样本的全血基因组dna，再通过nanodrop2000超微量分光光度计(美国，thermofisherscientific)检测所得dna的浓度，以供dhfr基因启动子区dna甲基化水平的检测。3、dna甲基化水平测定本实验采用荧光定量实时pcr(qmsp)对dhfr基因启动子区的cpg位点(如图1)进行dna甲基化水平分析。此技术的基本原理：利用荧光技术对基因序列进行标记，并使得基因序列在进行扩增时能够被灵敏检测。经由聚合酶链反应(pcr)之后，使得基因序列进行倍数扩增，每一个血样对应不同的扩增曲线。曲线与既设阈值相交的横坐标点即为对应ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时经历的循环数)。甲基化参考值的百分比(pmr)用2−δδct量化方法，即δδct=dna样本(ct靶基因-ctactb)—完全dna甲基化样本(ct靶基因-ctactb)，得出具体的甲基化率。用于实验的pcr扩增引物如下：甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-tatttgagcggtggttag-3’；甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-tctactataacgaacgaactc-3’。4、验证所得数据的准确性利用测序技术对qmsp所得甲基化率的准确性进行验证。5、数据分析本次实验采集大量的临床数据并得出一系列实验数据，采用spss16.0对数据进行整理分析。从统计学角度考量，p值小于0.05具有统计学意义。由表1可见：基因启动子区域高甲基化是导致脑卒中患者发病的一个较大危险因素(pc=1.12e-08)，而高血压等潜在的因素也会大大提高脑卒中患者的患病风险，他们之间的甲基化水平差异有着较好的统计学意义(pa=3.38e-12)。据表3可知宁波地区和深圳地区的脑卒中患者的甲基化率存在显著差异，且在年龄和生化指标tg表现出明显的差异。由表3和表4显示宁波地区和深圳地区的正常人的诸多生化指标(如ua、tg、tc等)皆有着明显的不同(p<0.05)，据表5可知，仅深圳地区age，ua与脑卒中的相关性有统计学意义，可见地域因素也是脑卒中患者发病的一个不容忽视的原因。本发明挑选出dhfr基因的启动子区域作为研究对象，由图1中“a”部分可知被检测序列所在区域具体位置为chr5:79950220—79950350，据此进行后续甲基化分析；由图1中“b”部分的dna序列分析结果表明，模板dna的亚硫酸氢盐转化成功；图1中“c”部分显示毛细管电泳证实扩增片段长度为131bp。注：图表中n表示样本个数，p值是两个数组之间进行对照的结果，若其小于0.05，则表示这两个数组间具有较大的统计学差异，表述为阳性结果，用字符加粗来强调。pa是脑卒中患者与高血压患者进行对比的结果；pb是脑卒中患者与正常人进行对比的结果；pc是高血压患者与正常人进行对比的结果。不符合正态分布的数据，用中位数(四分位数)来表示，其计算所得p值后加#；符合正态分布的数据，用平均数±方差来表示，其计算所得p值后加*，具有其合理性。本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。sequencelisting<110>宁波市疾病预防控制中心<120>一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法<130><160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1tatttgagcggtggttag18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tctactataacgaacgaactc21当前第1页12