本发明涉及一种gapdh基因检测用引物组合及试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
gapdh或g3pdh是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kda的亚基组成，分子量146kda。该酶基因为管家(housekeeping)基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作pcr、抽提totalrna，poly(a)+rna，westernblot等实验操作的标准化的内参。
随着检验医学的发展，一些分子生物学技术，如pcr、链置换扩增等，在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。然而，由于分子生物学技术检测核酸对仪器、设备的要求较高，操作程序复杂，限制了其作为快速诊断方法的开展与推广，环介导等温扩增技术(loopmediatedisothermalamplification,lamp)解决了核酸诊断中设备昂贵、程序复杂等难题。
lamp反应仅需一种具链置换活性的dna聚合酶(如bst、gsp等)及针对靶基因6-8个区域设计的4-6条引物(f3/b3和fip/bip必需，lf/lb可选)便可在60℃～66℃的恒定温度下实现几十分钟内大于109倍的靶基因扩增，其检测的低限可达10拷贝/微升，凭借极高的扩增效率及较低的仪器要求，该技术已逐渐应用于病原体识别、生物标志物检测、性别鉴定等，值得注意的是：lamp技术在床旁快速检测、野外检测及资源有限的基层实验室检测领域有旷阔的前景。
然而，近年来lamp技术在实验室中的实际应用相对局限，进展相对缓慢，本课题组根据前期的研究发现，限制其广泛应用的重要原因有两个，具体为：(1)当前的lamp体系难以实现真正意义上的高通量的检测，有待于进一步完善；(2)虽然lamp体系，检测过程中无需升降温，可以大大加快反应速度，实现高效、快速检测，然而与传统的实时pcr法相比，lamp体系的稳定性较差，经常会出现因样本核酸提取失败或样本中含有过多的pcr抑制剂导致的扩增失败，从而导致假阴性结果的出现，因此，为了避免假阴性，提高检测结果可信度，需要引入内对照扩增体系，对样本处理和检测的过程进行有效监控。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提出一种gapdh基因检测用引物组合及试剂盒。针对人源生物样本，以人gapdh基因上的一段高度保守的靶序列，设计引物，建立了gapdh-lamp检测体系并进行优化，成功建立了人源化样本lamp法扩增的内参质控体系，对于将来lamp法在临床的广泛应用奠定初步的基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种用于人gapdh基因检测的靶序列，所述序列如seqidno.1所示。
第二方面，本发明提供了一种根据前述靶序列设计的引物组合，所述引物组合包括f3、b3、fip、bip、lf、lb；所述引物f3的序列如seqidno.2所示，引物b3的序列如seqidno.3所示，引物fip的序列如seqidno.4所示，引物bip的序列如seqidno.5所示，引物lf的序列如seqidno.6所示，引物lb的序列如seqidno.7所示。
第三方面，本发明提供了一种引物组合在检测gapdh基因中的应用。
第四方面，本发明提供了一种用于人gapdh基因检测的lamp试剂盒，包括扩增反应体系，所述扩增反应体系的总体积为25μl，包括：2×反应缓冲液12.5μl，引物f3：1μl，引物b3：1μl，引物fip：0.5μl，引物bip：1μl，引物lf：1μl，引物lb：1μl，bstdna聚合酶1μl，钙黄绿素1μl，去离子水3.0μl，人基因组dna模板2μl。
优选地，所述引物f3和引物b3的终浓度为0.2μmol/l，引物fip和引物bip的终浓度为1.6μmol/l，引物lf和引物lb的终浓度为0.8μmol/l。
优选地，所述bstdna聚合酶的浓度为8u。
第五方面，本发明提供了一种检测人gapdh基因的方法，包括以下步骤：采用前述的lamp试剂盒进行lamp反应，反应结束后，通过反应液的颜色变化进行判定，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。
优选地，所述lamp反应的条件为：反应温度65℃，反应时间60min。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
以人gapdh基因上的一段高度保守的靶序列，设计引物，该引物组合用于lamp检测试剂盒中，结果表明引物组合未出现引物内部的非特异性扩增和引物与模板的非特异性结合扩增，由此建立了gapdh-lamp检测体系并进行优化，成功建立了人源化样本lamp法扩增的内参质控体系，对于将来lamp法在临床的广泛应用奠定初步的基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1、为本发明实施例的检测结果示意图；其中，a1:临床野生型基因组dna为模板，a2:108copies/ml的质粒样本，a3:107copies/ml的质粒样本，a4:106copies/ml的质粒样本，a5:105copies/ml的质粒样本，a6:104copies/ml的质粒样本，a7：103copies/ml的质粒样本，a8：阴性对照样本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1gapdh-lamp检测体系建立
(1)以人gapdh基因上的一段高度保守的靶序列，设计引物，所述靶序列长185bp，具体为:
gaaccagcaccgatcacctcccatcgggccaatctcagtcccttcccccctacgtcggggcccacacgctcggtgcgtgcccagttgaaccaggcggctgcggaaaaaaaaaagcggggagaaagtagggcccggctactagcggttttacgggcgcacgtagctcaggcctcaagaccttgggc(seqidno.1)
所述引物序列如表1所示。
表1
(2)所采用的试剂盒包括扩增反应体系，该扩增反应体系的总体积为25μl，其包括2×反应缓冲液(rm)12.5μl，引物f3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物b3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物fip：0.5μl(终浓度1.6μmol/l)，引物bip：1μl(终浓度1.6μmol/l)，引物lf：1μl(终浓度0.8μmol/l)，引物lb：1μl(终浓度0.8μmol/l)，bstdna聚合酶1μl(8u)，钙黄绿素(fd)1μl，去离子水3.0μl，dna模板2μl。
采用上述试剂盒进行lamp反应，lamp反应条件为：65℃，60min；所用的设备为普通pcr仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；然后进行可视化判读来鉴定样本是否为阳性，结果判断具体为：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。
实施例2gapdh基因的lamp检测
构建含靶序列(seqidno.1)的ta克隆质粒，制备梯度浓度的双份样本，具体浓度为103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml、107copies/ml、108copies/ml，用实施例1所建立的gapdh-lamp反应体系进行检测，均能检出，结果如图1所示。其中，a1：人外周血基因组dna为模板，a2：108copies/ml的质粒样本，a3：107copies/ml的质粒样本，a4：106copies/ml的质粒样本，a5：105copies/ml的质粒样本，a6：104copies/ml的质粒样本，a7：103copies/ml的质粒样本，a8：阴性对照样本。a1-a7样本的体系经60min扩增后，均变绿变浑浊，呈现阳性结果；a8为阴性对照，经60min扩增后，无任何变化，依然淡黄色澄清，呈现阴性结果。
综上所述，本发明具有如下的有益效果：
以人gapdh基因上的一段高度保守的靶序列，设计引物，该引物组合用于lamp检测试剂盒中，结果表明引物组合未出现引物内部的非特异性扩增和引物与模板的非特异性结合扩增，由此建立了gapdh-lamp检测体系并进行优化，成功建立了人源化样本lamp法扩增的内参质控体系，对于将来lamp法在临床的广泛应用奠定初步的基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
sequencelisting
<110>曹国君
<120>gapdh基因的lamp检测用引物组合及试剂盒
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