一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法与流程

技术领域：

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法。

背景技术：
：

海马(hippocampus)隶属于海龙科，海马属(synagnathidae：hippocampus)，是国家二级保护动物，国际濒危动物保护组织特定保护鱼类(cites,2004)，广泛分布于热带或亚热带的浅海海域，具有极高的经济价值，在我国素有南方人参之称。在全球范围内，海马资源分布不均，但主要分布在热带或亚热带的浅海中，如澳大利亚和新西兰附近海域、东南亚海域和美洲东部沿海等都是重要的海马栖息地。在已经报道的33种海马中，东南亚海域已经发现27种；马来西亚、印度尼西亚群岛、菲律宾以及中国的南沙群岛非常可能是目前国际海马种类最多、数量最大的海域；而该海域由于季风、洋流等自然条件复杂，海马的种类鉴定及其系统进化一直是系统分类中的难题。

目前，海马资源的最大威胁来自于传统中药的冲击，由于过度捕捞和沿海海域污染等原因，野生海马资源濒临枯竭。海马养殖业的兴起在一定程度上缓解了对野生海马资源的捕捞压力。海马种间亲缘关系较近，容易出现杂交现象。由于杂交海马容易建立品系更为优良的海马，种间杂交的方法已被广泛的应用。

但由于杂交海马通常同时具有两种亲本的形态特征，非常容易造成混淆，单纯从形态上鉴定杂交海马极其困难，因此本应用通过借助分子检测手段解决杂交海马的鉴定问题。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法。

本发明的第一个目的是提供一种杂交海马及其亲本的鉴定引物，所述的鉴定引物如下所示：

针对海马核基因rag1：

rag1f：5’-gaagcggaccacgagtcact-3’(如seqidno.1所示)；

rag1r：5’-acagtttgttcgccgactcg-3’(如seqidno.2所示)；

针对海马线粒体基因cytb：

cytbf：5’-ctacctgcaccatcaaacatctc-3’(如seqidno.3所示)；

cytbr：5’-cgaaaggtaagtcctcgttg-3’(如seqidno.4所示)。

本发明的第二个目的是提供一种杂交海马及其亲本的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取待测海马的基因组dna为模板，利用上述的针对海马核基因rag1的鉴定引物rag1f和rag1r进行pcr扩增；

2)将步骤1)扩增得到的pcr产物进行测序，若所得序列中无单核苷酸杂合位点，则可断定待测海马为纯种的海马个体；若所得序列中存在单核苷酸杂合位点，将pcr产物进行纯化，将纯化后的pcr产物连接到载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆子进行测序，获得两种海马核基因rag1等位基因的序列；

4)分别将步骤2)获得的两种海马核基因rag1的等位基因序列在ncbi数据库上进行同源性比对，若两种海马核基因rag1的等位基因序列与同一种海马的同源性最高，则该待测海马为纯种的海马个体；若两种海马核基因rag1的等位基因序列分别与两种海马的同源性最高，则该待测海马为这两种海马的杂交个体；

5)当待测海马为杂交海马时，以步骤1)提取的基因组dna为模板，利用上述的针对海马线粒体基因cytb的鉴定引物cytbf和cytbr进行pcr扩增，将扩增得到的pcr产物进行测序，获得该杂交海马线粒体基因cytb的基因序列；

6)将步骤5)所得到线粒体基因cytb的基因序列在ncbi数据库上进行同源性比对，与其同源性最高的海马种类则为该杂交海马的母本，推断另一种海马则为该杂交海马的父本。

步骤1)和5)所述的pcr扩增，其反应体系均优选为：25μl，包括基因组dna50ng，10×pcr缓冲液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量为ddh2o。

步骤1)所述的pcr扩增，其反应条件优选为：94℃预变性4min；94℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。

步骤5)所述的pcr扩增，其反应条件优选为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。

本发明的第三个目的是提供上述的杂交海马及其亲本的鉴定引物在鉴定杂交海马及其亲本中的应用。

核基因重组激活基因1(rag1)为单拷贝基因，包含着父母本的遗传信息，可作为杂交物种鉴定的检测基因，而线粒体细胞色素b(cytb)基因为母系遗传基因，只含有母本的信息。因此，本发明结合海马核基因rag1和线粒体基因cytb，设计并合成这两个基因的通用引物，并借助ncbi中nr库收录的海马相关序列的信息，建立了杂交海马及其亲本的鉴定方法，可快速、准确鉴定杂交海马及其父母本来源，从而为海马的选育及开发利用提供参考依据。

附图说明：

图1是待测海马rag1-1序列在ncbi中blastn的比对结果。

图2是待测海马rag1-2序列在ncbi中blastn的比对结果。

图3是待测海马cytb序列在ncbi中blastn的比对结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1)选取深圳大鹏养殖场上的线纹海马和吻海马的杂交海马，使用天根生物公司的海洋动物提取试剂盒提取基因组dna；

2)设计并合成海马核基因rag1的通用引物，引物序列如下：

rag1f：5’-gaagcggaccacgagtcact-3’(如seqidno.1所示)；

rag1r：5’-acagtttgttcgccgactcg-3’(如seqidno.2所示)。

3)以步骤1)提取的基因组dna为模板，利用步骤2)的海马核基因rag1的通用引物rag1f和rag1r进行pcr扩增。pcr扩增的反应体系为：25μl，包括基因组dna50ng，10×pcr缓冲液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量为ddh2o。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。扩增得到目的大小为919bp的pcr产物。

4)将步骤3)所得的pcr产物用步骤2)的海马核基因rag1的通用引物直接测序，通过峰图发现测序结果为双峰，即所得序列中存在单核苷酸杂合位点，将pcr产物利用胶回收试剂盒纯化，然后连接到pgem-t载体中，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序，获得两种海马核基因rag1等位基因的序列，分别命名为rag1-1(如seqidno.5所示)和rag1-2(如seqidno.6所示)。

5)分别将步骤4)获得的两种海马核基因rag1等位基因的序列登陆到ncbi网站进行blastn比对，发现rag1-1序列与线纹海马(h.erectus)同源性最高(99％)，区别位点仅仅是上游引物一碱基不匹配导致的(图1)，而rag1-2序列与吻海马(h.reidi)同源性最高(99％)，区别位点仅仅是上游引物一碱基不匹配导致的(图2)，因此证实该海马为线纹海马与吻海马的杂交个体。

6)由于线粒体基因为母系遗传，因此，可通过海马的线粒体细胞色素b(cytb)基因的序列，判断此杂交海马的母本。进而设计并合成海马线粒体基因cytb的通用引物，引物序列如下：

cytbf：5’-ctacctgcaccatcaaacatctc-3’(如seqidno.3所示)；

cytbr：5’-cgaaaggtaagtcctcgttg-3’(如seqidno.4所示)。

7)以步骤1)所得的基因组dna为模板，使用步骤6)的海马线粒体基因cytb的通用引物cytbf和cytbr进行pcr扩增。pcr扩增的反应体系为：25μl，包括基因组dna50ng，10×pcr缓冲液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量为ddh2o。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。扩增得到目的大小为893bp的pcr产物，将pcr产物直接测序，获得该杂交海马线粒体基因cytb的基因序列(如seqidno.7所示)。

8)将步骤7)获得的杂交海马线粒体基因cytb的基因序列登陆到ncbi网站中blanstn比对，发现该序列与吻海马(h.reidi)同源性最高(100％)(图3)，因此该杂交海马的母本为吻海马，从而推断其父本为线纹海马。鉴定结果与已知结果一致。

实施例2：

以纯种的线纹海马为待测海马，提取该纯种的线纹海马的基因组dna为模板，利用实施例1步骤2)的海马核基因rag1的通用引物rag1f和rag1r进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系和反应条件与实施例1步骤3)相同。对扩增得到的pcr产物直接测序，分析测序的峰图，发现所得的测序序列的峰图为单峰，即所得序列中无单核苷酸杂合位点，则可判定该待测海马为纯种的海马个体。将获得的序列登陆到ncbi网站进行blastn比对，发现该序列与线纹海马(h.erectus)同源性最高(99％)，区别位点仅仅是上游引物一碱基不匹配导致的，判断为纯种的线纹海马个体。鉴定结果与已知结果一致。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法

<160>7

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaagcggaccacgagtcact20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acagtttgttcgccgactcg20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctacctgcaccatcaaacatctc23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgaaaggtaagtcctcgttg20

<210>5

<211>919

<212>dna

<213>线纹海马（h.erectus）

<400>5

gaagcggaccacgagtcactcacagctgtcttggcgcccatggtcgccgagcgtaacgcg60

atgaaggagagcaggcttatcctgtccatagctggcctgcctcgatctttccgcttccac120

tttagagggtcgggatacgatgaaaagacggtacgtgaatttgagggcttggaagcctcc180

ggatccacttacgtctgcacactgtgtgattccagtcgagtggaggcctctaaaaatatg240

gtgctccactccgtcacacgcagtcatgaggagaacctggcacgttatgaaatctggcga300

accaacccattttctgagtcagtagaggaactgcgggacagagtcaaaggggtctctacc360

aagcccttcatagagacccattccacaattgatgcattgcattgtgagattggaaatgcc420

accgagttctacaaaattttccaggacgaaataggggaggtgtaccgaaaggaaaacccc480

agccgggaggaacgacgcagctggcgggcagccctagataaagaactgaggcataagctg540

aagctcaaacctgtgatgaggatgaatggcaactacgcccgtaagctaatgacccttgag600

gcggtgcaagtggtgtgtgagctggtcccctcggaggagaggagggaggccctgaggaag660

ctgatgaggttataccttcagatgaagcctgtgtggcgctccacctgcccagccaaggag720

tgtcctgaccaactttgctgctactcctttaactcccagagtttcgctgacctaatctcc780

actaccttcaaataccgctacaaaggtaaaataaccaactacctgcacaagaccctggcc840

cacgtccccgaaataatagagcgagatggatctatcggtgcctgggccagtgaggggaac900

gagtcggcgaacaaactgt919

<210>6

<211>919

<212>dna

<213>吻海马（h.reidi）

<400>6

gaagcggaccacgagtcactcacagctgtcttggcgcccatggtcgcagagcgtaacgca60

ataaaggagagcaggcttatcctgtccatagctggcctgcctcgatctttccgcttccac120

tttagagggtcgggatacgatgaaaagatggtacgcgaatttgagggcttggaagcctca180

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cacgtccccgaaataatagagcgagatggatctatcggtgcctgggccagtgaggggaac900

gagtcggcgaacaaactgt919

<210>7

<211>893

<212>dna

<213>吻海马（h.reidi）

<400>7

ctacctgcaccatcaaacatctctgtatgatgaaacttcggatccttactaggattatgc60

ttaattgcccaaatccttacaggattatttctagcaatacactatacctcagatattgca120

accgcattctcttcagtaacacatatttgccgggacgtaaattacggttgactaattcgc180

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