紫甘蓝内参基因、引物对及用途的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及紫甘蓝内参基因、引物对及用途，特别涉及紫甘蓝内参基因18srrna的序列、克隆方法及其作为内参基因的扩增引物和其在rt-qpcr中的应用。

背景技术：

紫甘蓝(brassicaoleraceal.var.capitataf.rubradc.)为十字花科芸薹属，甘蓝变种。紫甘蓝的营养丰富，尤以丰富的维生素c、较多的维生素e、维生素b，以及丰富的花青素甙、矿物质和纤维素等，备受人们的欢迎。紫甘蓝的主要营养成分与结球甘蓝差不多，但含有的维生素成分及矿物质都高于结球甘蓝，并且含有大量天然色素，故公认紫甘蓝的营养价值高于结球甘蓝。此外，紫甘蓝不仅营养丰富，而且结球紧实，色泽艳丽，抗寒。耐热，产量高，耐贮运，是很受欢迎的一种蔬菜。紫甘蓝在欧洲地区主要作为色拉菜或西餐配色用，随着改革开放的逐步深入，特别是国际交往的日益频繁，我国对紫甘蓝的需要量也日渐增多，众多大城市近郊菜区已把紫甘蓝列为花色蔬菜而种植。

紫甘蓝在工业、科研、医药、食品加工等行业中的应用逐渐受到重视，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示紫甘蓝基因表达和调控的机理。实时荧光定量pcr(qpcr)是目前研究基因定量表达的主要方法。为了避免不同样本的rna质量、产量、逆转录效率以及扩增效率上存在差异，在做基因表达分析时，通常会引入看家基因(act、18srrna、gapdh、ubqtua、tub和ef-1α等)作为内参基因进行数据校正从而减少样本之间的误差。根据特定实验材料及条件选择合适qpcr分析的内参基因，对于准确校正目的基因的表达至关重要。理想的内参基因在不同组织类型、生长阶段及不同实验条件下，其表达水应该平均保持一致。一般来讲，常选择稳定表达的看家基因作为内参基因。然而，近来研究表明，任一看家基因的稳定表达只是在一定范围内的相对稳定，若不加筛选就盲目以一种看家基因作为任何实验条件下的内参，会导致结果精确度低甚至错误。因此，在利用qpcr进行基因表达分析时，应该根据特定实验材料和条件选择合适的内参基因。

但是，目前紫甘蓝的分子生物学研究还在起步阶段。关于紫甘蓝的内参基因的研究还未见报道。目前也未发现实时荧光定量pcr技术应用于紫甘蓝中基因表达水平的研究。缺乏内参基因，难以实现对基因表达水平的校正和标准化，也不能对基因在不同条件和发育时期下的表达水平进行研究和比较，大大阻碍了紫甘蓝中各种基因的表达特性研究和基因功能分析研究。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因。

本发明另有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因扩增引物对。

本发明还有一个目的是提供一种紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对。

本发明另有一个目的是提供一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒。

本发明还有一个目的是提供内参基因或实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如seqidno：1所示。

紫甘蓝内参基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如seqidno：2所示的碱基序列和如seqidno：3所示的碱基序列。

紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如seqidno：4所示的碱基序列和如seqidno：5所示的碱基序列。

一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含所述的引物对。

所述的内参基因或所述的实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。

本发明不仅解决了现有紫甘蓝定量pcr检测中没有内参基因的现状；而且所涉及的引物特异性强，大大提高了采用实时荧光定量pcr技术检测紫甘蓝中基因表达分析的稳定性和可靠性。

本发明至少包括以下有益效果：

1.本发明首次克隆得到紫甘蓝的18srrna基因片段；

2.本发明首次提出在紫甘蓝定量pcr检测中建立通用的内参基因；

3.本发明首次提出将紫甘蓝18srrna基因作为内参基因用于紫甘蓝在不同品种和不同发育时期的定量pcr检测，解决了紫甘蓝定量pcr检测中没有内参基因的现状；

4.本发明提出的检测引物对具有特异性，优化了pcr扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及紫甘蓝基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1是本发明实施例2中的1％琼脂糖电泳图；

图2是本发明实施例2中实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图3是本发明实施例2中实时荧光定量pcr溶解曲线图；

图4是本发明实施例3中实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图5是本发明实施例3中的2％琼脂糖电泳图；

图6是本发明实施例4中实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图7是本发明实施例5中实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图8是本发明实施例6中实时荧光定量pcr扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种紫甘蓝内参基因，其碱基序列如seqidno：1所示。该内参基因为18srrna基因。

本发明还提供一种紫甘蓝内参基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如seqidno：2所示的碱基序列和如seqidno：3所示的碱基序列。

紫甘蓝18srrna基因的核苷酸序列的克隆方法，提取紫甘蓝总rna，采用oligod(t)反转录并作为产物第一链cdna为模板，利用引物对18srrna-f(seqidno：2)和18srrna-r(seqidno：3)进行pcr扩增，筛选得到阳性克隆，最后经测序验证。所述pcr的扩增反应条件如下：94℃预变性3min，【98℃变性10s、54℃退火30s、68℃延伸1min】30个循环，68℃再延伸5min。

本发明还提供一种紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如seqidno：4所示的碱基序列和如seqidno：5所示的碱基序列。

本发明还提供一种qpcr扩增18srrna基因部分序列的方法，提取紫甘蓝的总rna，利用dnasei去除gdna后，以oligod(t)为引物进行反转录，然后以产物第一链cdna为模板进行荧光定量pcr反应。荧光染料为sybggreeni。所述荧光定量pcr扩增的方法采用三步法，即在95℃预变性15min，运行40个循环的95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，再运行溶解曲线阶段的95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s的分析。

本发明克隆了紫甘蓝中18srrna的基因片段。设计了相应的特异性基因定量引物，建立了基于sybggreeni染料技术的realtimepcr方法，从而为紫甘蓝中基因表达水平分析提供了有用的方法。

本发明还提供一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含所述的实时荧光定量引物对。

本发明还提供一种所述的内参基因或所述的实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。

为使本领域技术人员更好地理解本发明，现提供如下的实施例进行说明：

实施例1紫甘蓝18srrna基因的克隆

1.1紫甘蓝总rna的提取：

使用植物rna提取试剂盒(rnapreppureplantkit，dp441tiangen)提取总rna。取新鲜材料后立即用锡箔纸包好并保存在液氮中，材料保存于-80℃冰箱待用。提取过程中使用的枪头和离心管，水均为depc处理过夜并于121℃高压灭菌40min备用。磨样所用的研钵和研棒提前用锡箔纸密封并于121℃高压灭菌40min。具体方法如下：取约100mg新鲜植物样品在液氮中充分研磨，将粉末加入液氮预冷的1.5mlep管中，迅速加入500μl的裂解液sl(用前加入终浓度为5％的β-巯基乙醇)，立即漩涡剧烈震荡混匀，室温静置10min。12,000rpm离心2min。将上清移至过滤柱cs中，12,000rpm离心1min。将收集管中的上清转移至新的rnase-free的离心管中，加入0.4倍体积的无水乙醇，混匀并将得到的溶液和沉淀转移至吸附柱cr3中，12,000rpm离心1min。倒掉收集管中的废液，向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心1min。倒掉收集管中的废液，取70μlrdd溶液和10μldnasei混匀后加到吸附柱中，室温静置30min。离心并向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，静置2～5min后离心，加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心1min。重复用500μl漂洗液rw洗涤一次。倒掉收集管中的废液，12,000rpm离心2min将吸附柱cr放入新的1.5mlrnase-free离心管中，置于超净工作台吹干，加入50μl65℃预热的rnase-freeddh2o，静置2min后于12,000rpm离心2min收集rna。提取的rna进行电泳检测，并用nanodrop-2000紫外分光光度计测定浓度，并于-80℃保存备用。

1.2反转录

以紫甘蓝总rna为模板，anchoredoligo(dt)20(0.5μg/μl)为引物合成第一链cdna。使用transscriptiifirst-strandcdnasythesissupermix(ah301-02transgen)试剂盒进行反转录，20μl体系如下：加入10μl的2×tsiireactionmix、2.0μgtotalrna、1.0μltransscriptiirt/rienzymemix以及1.0μl的反转录引物，用rnase-freeddh2o补充总体积为20.0μl。将各成分混匀后，50℃孵育30min后85℃加热5s。将所得到cdna第一条链产物稀释10倍后，即可进行rt-pcr扩增。

1.3聚合式酶链反应

以反转录得到的第一链cdna为模板进行pcr扩增。

pcr扩增引物序列如下：

18srrna的上游引物(seqidno：2)：5’-gattcatcgccgttcgtcttc-3；

18srrna的下游引物(seqidno：3)：5’-aatagaagaggacaaagcttaatgc-3’。

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

pcr采用50μl反应体系：先加入31.5μlddh2o，再分别加入10μl5×fasthifidelitypcrbuffer、2.5μl20×fastpcrenhancer，上游和下游引物(10μm)各2.0μl、以及cdna模板和fasthifidelitypolymerase(2.5u/μl，kp202-01tiangen)各1.0μl。扩增反应条件如下：94℃预变性3min，然后98℃变性10s、54℃退火30s、68℃延伸1min进行30个循环，最后68℃再延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段(图1)。

胶回收目的条带，连接于peasy-t1载体，并转化大肠杆菌感受态trans5αchemicallycompetentcell，活化后涂于lb平板至长出单克隆，挑取白色菌落于lb液体培养基中进行摇菌，pcr菌液检测后挑取阳性克隆进行测序。序列如seqidno：1所示。

实施例2.实时荧光定量pcr设计和荧光定量pcr检测

以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，遵循实时荧光定量pcr引物设计原则设计荧光定量特意引物，其扩增片段为85bp。该对荧光定量特异引物即为所述的实时荧光定量pcr引物(如seqidno：4和5所示)：正向引物为：q18srrna-f(seqidno：4)：5’-ttaggtttccgtgcaggagt-3’，反向引物为：q18srrna-r(seqidno：5)：5’-catgcgatgacttgtccg-3’。样品取3份材料作为独立的实验重复。cdna模板分别稀释50倍用于下述荧光定量pcr反应。

利用takarafastqpcrkit试剂盒(rr430btakara)进行荧光定量pcr。首先将反转录产物稀释为5ng/μl，然后取3μl样品进行检测，每个样品设置3次技术重复。荧光定量pcr反应总体积为20μl，体系如下：10.0μl2×sybrfastqpcrmastermix、实时荧光定量pcr正向引物(10μm)和反向引物(10μm)各0.6μl以及3.0μl稀释50倍的cdna模板，用rnase-freeddh2o补充至总体积为20μl。

按照以上体系加入96孔板，混匀，100×g水平离心1min。

将96孔板放入steponeplusrealtimepcrinstrument(appliedbiosystem)，按照如下三步法程序进行pcr循环反应：即在95℃预变性15min，运行40个循环的95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，再运行溶解曲线阶段的95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s的分析。每个反应做3个重复。

采用2^-δδct法计算基因的相对表达量。用内参基因的ct值归一化目标基因的ct值，即△ct(测试样品)＝ct(目标基因)-ct(内参基因)、△ct(校正样品)＝ct(目标基因)-ct(内参基因)，再用校正样品的△ct值归一测试样本的△ct值：△△ct＝△ct(测试样品)-△ct(校正样品)。基因的相对表达量＝2^-δδct计算各个基因在不同样品中的基因表达相对变化，比较样品目标转录本之间的表达差异。

反应结果如图2所示。从图2可以看出，3次重复的荧光定量pcr扩增曲线均较好，ct值为20.18±0.02。熔解曲线分析(图3)显示，3次重复的tm值(溶解温度)稳定且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现。表明所设计的一对引物特异性强，能够用于紫甘蓝荧光定量pcr的内参引物实验。

实施例3紫甘蓝18srrna基因表达稳定性分析

按照上述实施例1中1.1的rna提取方法，提取不同紫甘蓝样品(样品编号1、2、3、4、5、6)和紫甘蓝不同发育时期样品(p1、p2、p3和p4)的总rna，并按照实施例1中1.2的方法合成cdna第一链。每个样品取3份材料作为独立的实验重复。cdna模板分别稀释50倍用于下述荧光定量pcr反应。荧光定量pcr反应的体系和程序按照实施例2中所述进行实验。扩增曲线如图4所示，18srrna基因在不同的样品间表达均很稳定，ct值分别为20.33±0.13、20.18±0.02、19.86±0.13、19.91±0.05、20.80±0.07、20.03±0.14、19.96±0.32、19.92±0.08、20.46±0.03、20.27±0.04。用genorm软件分析计算其stabilityvalue为0.088，远远低于其他内参基因的值，说明18srrna在不用的样品和发育时期均稳定性表达。

以上述cdna为模板，实施例2中的实时荧光定量引物对分别进行pcr扩增。扩增体系如下：2.0μl10×taqpcrbufferii(mg²⁺plus)、2.0μldntps(10mm)，上游和下游引物(10μm)各1.0μl、以及1.0μlcdna模板和0.2μltakarar-taq(5u/μl)，最后加入ddh2o补充总体积至20μl。扩增反应条件如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s进行30个循环，最后72℃再延伸5min。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。检测结果如图5所示，所扩增的10个条带亮度基本一致，从而表明紫甘蓝的18srrna在不同的样品中和不同发育时期均能稳定表达，说明了实时荧光定量引物18srrna在紫甘蓝基因表达中的稳定性，从而适用于紫甘蓝基因表达的研究。

实施例4紫甘蓝heatshockprotein基因表达稳定性分析

依照实施例3中同样的方法，利用如下引物对检测heatshockprotein基因的表达稳定性，结果如图6所示。各个样品的ct值范围为18.09±0.02～25.43±0.07，根据各个样品中的ct值用genorm软件分析计算该基因的stabilityvalue为1.14，远远高于18srrna基因的值，说明该基因的表达稳定性远不如18srrna。

hsp-f(seqidno：6):5-ctttccttagggcggcgaga-3

hsp-r(seqidno：7):5-ccagccaccatccctccaag-3

实施例5紫甘蓝actin基因表达稳定性分析

依照实施例3中同样的方法，利用如下引物对检测actin基因的表达稳定性，结果如图7所示。各个样品的ct值范围为22.55±0.07～27.79±0.06，根据各个样品中的ct值用genorm软件分析计算该基因的stabilityvalue为0.58，远高于18srrna基因的值，说明该基因的表达稳定性远不如18srrna。

actin-f(seqidno：8)：5-cgagcaagagctggagacgg-3

actin-r(seqidno：9)：5-cttccatccccacgagcgac-3

实施例6紫甘蓝tublin基因表达稳定性分析

依照实施例3中同样的方法，利用如下引物对检测tublin基因的表达稳定性，结果如图8所示。各个样品的ct值范围为19.86±0.16～23.45±0.07，根据各个样品中的ct值用genorm软件分析计算该基因的stabilityvalue为0.55，远高于18srrna基因的值，说明该基因的表达稳定性远不如18srrna。

tub-f(seqidno：10)：5-ctcgctcttggaacacactg-3

tub-r(seqidno：11)：5-tgagagacgagacggttgag-3

综上，本发明提供了一种紫甘蓝内参基因，并揭露了利用该紫甘蓝基因为基础设计的实时荧光定量pcr引物。不仅解决了现有紫甘蓝定量pcr检测中没有内参基因的现状，而且所设计的引物用于紫甘蓝基因表达分析时，特异性强。大大提高了采用实时荧光定量技术检测紫甘蓝基因表达时的检测效率，提高了检测结果的可信度，以及紫甘蓝基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

sequencelisting

<110>中国农业科学院农产品加工所

<120>紫甘蓝内参基因、引物对及用途

<130>2016

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1205

<212>dna

<213>紫甘蓝（brassicaoleraceal.var.capitataf.rubradc.）

<400>1

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atgacgactccgaggcccgcaaatatacttcttcctcacgtatcgtcgaaattcaggcga180

ggttgtctgagagagctttggagcttcttgctttgcctgaagatgatgttcctagattct240

tgctcgatattggttgtggatctggcctgagcggggaaacaatctctgagaatgggcacc300

agtggattggtcttgacatctcagcctcaatgcttaacgttgctgttgaacgagaagttg360

agggtgatcttttacttggtgacatgggccagggcttaggtttccgtgcaggagtcatag420

acggagccatcagtatatcggctgttcagtggttatgcaatgcggacaagtcatcgcatg480

aacctcgtttgaggctaaaggctttctttgggtcactataccgatgcttatcaagaggag540

caagggcagttttccaagtgtaccctgagagtatcgctcagcgtgagttgatccttcgcc600

aggccttacaagctggatttggtggtggactcgttgttgactaccctcacagtactaaga660

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ataaagagggtgactcggatgatgacgatgatgatagcgaagaagaagagaatggaatgg780

taaatgatatatatatatatatatatatatatatatatattgaagtctccttaccgtctt840

acttgctgctatatatatagaagtgtttgtttaccattctttgttttgtttgtggaaagg900

tatgtgtgtcggataggagtaggccaaggaagaagcagagaacgaacaagaaagggaaag960

gaagggaatgggttttgaggaagaaggaacaaagtagaaggaaaggaaacgatgttcctg1020

ctgattccaagtacaccgcaaggaaacgcaagtcgcgtttctgatttttttttactagtc1080

ttaaaaaagcgttttattatgttacgtccttactctttctacatttcgtgtactcggaag1140

tcaaaacctgtggctacttctcaggtgcgtcttgtgatttgcattaagctttgtcctctt1200

ctatt1205

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tgagagacgagacggttgag20