一种快速区分玉米小斑病菌交配型的PCR检测方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速区分玉米小斑病菌（cochliobolusheterostrophus）交配型的pcr检测方法。本发明技术适用于对单孢分离获得的玉米小斑病菌交配型的检测。

技术背景

真菌的有性生殖可分为同宗配合（homothallism）和异宗配合（heterothallism）两大类。在同宗配合的真菌中有性生殖是由交配可亲和的一对雌、雄配子结合产生有性孢子从而形成新个体的繁殖方式，有性生殖是真菌界普遍存在的一种生殖方式。可见，异宗配合真菌必须由不同性别的菌丝细胞结合后才能产生子代的一种生殖方式。真菌的有性繁殖和交配亲合性主要受交配型基因的控制，同宗配合的真菌通常具有一个交配型基因位点；而大多数异宗配合的真菌同时具有一对高度异源的交配型基因位点。在异宗配合的子囊菌中，具有mat1-1和mat1-2两个高度异源的交配型基因位点。因此，可通过检测mat1-1和mat1-2基因从而确定异宗配合的子囊菌的交配型。

由玉米小斑病菌（有性态：cochliobolusheterostrophus；无性态：bipolarismaydis）引起的玉米小斑病是玉米上的重要叶部病害，该病害遍及亚洲、美洲、欧洲、非洲和大洋洲等玉米产区，是玉米产区普遍发生的重要病害之一。玉米小斑病菌在整个玉米生长期均可感染、危害，特别是玉米抽穗以后发生较重，此病主要危害叶片，也能危害叶鞘、苞叶、果穗和子粒。病害先发生于下部叶片，逐渐向上部叶片蔓延。一般在抗病品种上产生黄褐色坏死小斑点，周围有黄褐色晕圈，病斑不扩大，在感病品种上病斑椭圆形或纺锤形，病斑扩展受叶脉限制（或不受限制），黄褐色，边缘深褐色。在多雨潮湿时病斑上可产生灰黑色霉层（分生孢子梗和分生孢子），严重时病斑扩展到整个植株，导致整株玉米枯死。研究表明，玉米小斑病菌属子囊菌门旋孢腔菌属的异宗配合真菌，具有mat1-1和mat1-2两种交配型。

申请人根据turgeonetal.(moleculargeneticsandgenomics,1993,238(1):270-284)登录在genbank中的两种玉米小斑病菌交配型mat1-1基因序列（genbank登录号:x68399）和mat1-2基因序列（genbank登录号:x68398），设计了两对特异性引物用于检测玉米小斑病菌的交配型。与传统的交配型检测方法相比较，本发明大大缩短了检测玉米小斑病菌交配型的周期，其检测结果更加准确、快速和高效。同时，本发明为研究玉米小斑病菌的有性世代及其遗传变异奠定了实验基础。

本发明基于genbank中登录的两对玉米小斑病菌交配型基因序列，通过设计特殊引物和pcr反应条件的优化，保证了检测结果的可靠、特异和稳定性。该方法可快速检测经单孢分离获得的玉米小斑病菌菌株的交配型，适用于玉米小斑病菌及其交配型的流行预测及植物病理学相关领域的科学研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、检测结果可靠、特异和稳定，且易于操作的检测玉米小斑病菌交配型的pcr检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速区分玉米小斑病菌（cochliobolusheterostrophus）交配型的pcr检测方法，其中包括收集待检测的玉米小斑病菌菌丝，采用改良的ctab法提取待检测样本的基因组dna，pcr扩增结果用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用dl2000的dnamarker判断dna片段的大小，涉及的检测样本为单孢分离的玉米小斑病菌菌株，所述的pcr扩增体系中涉及的两对特异引物是chmat01-4和chmat02-3，其序列分别为：

chmat01-4f：5′-catctgccctcacctcaa-3′；

chmat01-4r：5′-catcttcatcggctccaa-3′；

chmat02-3f：5′-tgtgggcgaagtttgtgg-3′；

chmat02-3r：5′-aggcgatgtctgggctga-3′。

本发明中pcr扩增体系为：premixtaq(takarataq™version2.0plusdye,其中包括:takarataq,1.25u/25μl;dntpmixture,each0.4mm;2×taqbuffer,mg²⁺,3mm;色素marker,tartrazine/xylenecyanolff)12.5μl;10-50ng/μl的dna模板1μl;10mm的引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r，各1μl;补足ddh2o至25μl。mat1-1和mat1-2交配型检测的多重pcr扩增程序为：94℃,5min;94℃,45s,58℃,60s,72℃,90s,35个循环;72℃,10min;4℃保存。

在本发明中，mat1-1交配型单孢分离的玉米小斑病菌菌株可得到716bp的dna条带；mat1-2交配型单孢分离的玉米小斑病菌菌株可得到142bp的dna条带，据此获得被测玉米小斑病菌单孢分离菌株的交配型。

本发明的优点：提供了一种更加便捷、快速的检测玉米小斑病菌交配型的pcr检测方法，其检测结果更加可靠、特异和稳定，适用于大批量的玉米小斑病菌交配型的快速检测。同时为今后玉米小斑病菌的有性生殖及其遗传变异研究奠定了实验基础。

附图说明

图1本发明对玉米小斑病菌单孢分离菌株交配型的电泳检测图。m代表dl2000marker；1-10为玉米小斑病菌单孢分离菌株；ck为无dna模板对照。

图2本发明设计的特异引物chmat01-4和chmat02-3对玉米小斑病菌交配型检测特异性的电泳检测图。m代表dl2000marker；1~3和4~6分别为交配型为mat1-1和mat1-2的玉米小斑病菌单孢菌株；11~27分别为菌株cochlioboluscarbonum、cochliobolussp、cochlioboluslunata、cochlioboluseragrostidis、alternariasolani、ustilaginoideaoryzae、colletotrichumgloeosporioides、fusariumoxysporumf.sp.cubense、monilinialaxa、oosporacitriaurantii、rhizoctoniasolani、sclerotiniasclerotiorum、setosphaeriaturcica、sphacelomafawcetti、trichodermaharzianum、metarhiziumanisopliae和beauveriabassiana；ck为无dna模板对照。

图3本发明设计的特异引物chmat01-4和chmat02-3对玉米小斑病菌交配型检测灵敏性的电泳检测图。m代表dl2000marker；玉米小斑病菌mat1-1（上）和mat1-2（下）交配型的单孢菌株dna浓度分别为50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg和50fg。

具体实施方式

实施例1：玉米小斑病菌交配型基因检测特异引物的设计

根据genbank中登录的两条玉米小斑病菌交配型基因的dna序列mat1-1（genbank登录号:x68399）和mat1-2（genbank登录号:x68398）设计玉米小斑病菌交配型基因检测的特异引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r，其中chmat01-4f/chmat01-4r用于检测mat1-1交配型，chmat02-3f/chmat02-3r用于检测mat1-2交配型，其引物序列为：

chmat01-4f：5′-catctgccctcacctcaa-3′；

chmat01-4r：5′-catcttcatcggctccaa-3′；

chmat02-3f：5′-tgtgggcgaagtttgtgg-3′；

chmat02-3r：5′-aggcgatgtctgggctga-3′。

实施例2：供试菌株菌丝体的收集

供试的单孢分离的玉米小斑病菌菌株、近缘种菌株以及其他属菌株见表1。取保存的待测菌株接种于马铃薯蔗糖琼脂（pda）培养基平板上，25℃黑暗条件下培养3d，挑取新鲜菌丝，接种于装有100ml液体马铃薯蔗糖培养基的250ml三角瓶中。于25℃、180r/min的摇床上培养5d，双层无菌纱布过滤，用蒸馏水冲洗2~3次，再用滤纸吸干水分，取适量菌丝于2ml离心管-80℃冰箱中保存。

表1供试单孢菌株的编号、菌株名称、寄主以及交配型

实施例3：供试菌株dna的提取：

采用改进的ctab法提取供试菌株的dna，具体步骤如下：

1、将-80℃保存各供试菌株的菌丝于-60℃条件下冷冻干燥8h；

2、取适量菌丝粉于2ml的离心管中，加900μl2%的ctab提取液[2%ctab(w/v),0.1mtris-hcl(ph8.0),0.02medta,1.4mnacl]、90μl10%的sds和等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻柔混匀后于37℃、250r/min的摇床上振荡培养1~1.5h；

3、12000rpm、4℃条件下离心15min，取上清液（约600μl），加入等体积的异丙醇，-20℃条件下沉淀30min以上；

4、12000rpm、4℃条件下离心15min，弃上清液，加入1ml70%的乙醇洗涤沉淀1~2次，于无菌操作台上吹干；

5、加入50~100μlte（10mmtris-hcl,1mmedta,ph8.0）溶解dna，使用核酸定量仪测量dna浓度，并将浓度调整为约10~50ng/μl-20℃保存备用。

实施例4：pcr扩增

pcr扩增体系为：premixtaq(takarataq™version2.0plusdye，其中包括:takarataq,1.25u/25μl;dntpmixture，each0.4mm；2×taqbuffer,mg²⁺,3mm;色素marker,tartrazine/xylenecyanolff)12.5μl;10-50ng/μl的dna模板1μl;10mm的引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r，各1μl;补足ddh2o至25μl。

多重pcr扩增程序为：94℃,5min;94℃,45s,58℃,60s,72℃,90s,35个循环;72℃,10min;4℃保存。

取5ulpcr扩增产物在1.0%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为10v/cm，电泳结束后使用凝胶成像系统记录电泳结果。在本发明中，玉米小斑病菌mat1-1交配型可得到一条716bp左右的dna条带；mat1-2交配型可得到一条142bp左右的dna条带，据此获得被测玉米小斑病菌单孢分离菌株的交配型（图1）。

实施例5：引物特异性检测

利用实施例4的pcr体系检测特异引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r对玉米小斑病菌交配型的特异性。用于引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r的特异性检测菌株包括玉米小斑病菌mat1-1和mat1-2交配型的菌株各3株，分别为1~3和4~6（表1），近缘种菌株cochlioboluscarbonum、cochliobolussp、cochlioboluslunata、cochlioboluseragrostidis各1株，其他属菌株alternariasolani、ustilaginoideaoryzae、colletotrichumgloeosporioides、fusariumoxysporumf.sp.cubense、monilinialaxa、oosporacitriaurantii、rhizoctoniasolani、sclerotiniasclerotiorum、setosphaeriaturcica、sphacelomafawcetti、trichodermaharzianum、metarhiziumanisopliae和beauveriabassiana各1株。

采用实施例2设计的pcr扩增体系其扩增结果如图2。由图2可知：设计的玉米小斑病菌特异引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r分别仅能检测出交配型为mat1-1和交配型为mat1-2的玉米小斑病菌的交配型，而检测不出供试的玉米小斑病菌近缘种菌株以及其他属菌株。

实施例6：引物灵敏性检测

利用实施例4的pcr体系检测特异引物chmat01-4f/chmat01-4r和chmat02-3f/chmat02-3r对玉米小斑病菌交配型检测的灵敏性。取玉米小斑病菌mat1-1和mat1-2交配型的单孢菌株dna各1份，将其浓度分别稀释为50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg和50fg。

采用实施例4设计的pcr扩增体系其扩增结果如图3。由图3可知：特异引物chmat01-4f/chmat01-4r对玉米小斑病菌交配型的检测灵敏度为5pg；引物chmat02-3f/chmat02-3r对玉米小斑病菌交配型的检测灵敏度为500pg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种快速区分玉米小斑病菌交配型的pcr检测方法

<130>4

<160>4

<170>patentinversion3.3

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