一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域，是一种农杆菌介导的高效的研究外源基因在洋葱内表皮的亚细胞定位以及蛋白与蛋白互作的瞬时转化方法。

背景技术：

目标基因的瞬时表达是分析生物学功能的一个简单并且有用的的方法(Zhou et al.2009)。基因的瞬时表达在研究蛋白功能例如蛋白活性分析、亚细胞定位以及蛋白与蛋白互作方面提供了非常有用的信息(Lee et al.2008；Ueki et al.2009；Hollender and Liu 2010)。与操作复杂、昂贵且费时的稳定转化体系相比(Scott et al.1999)，瞬时转化的方法即快捷灵活又不影响染色体的位置并且可以用于高度分化的植物组织(Fischer et al.1999)。瞬时转化已经越来越多的被用于作为稳定转化的补充，加速深入研究的进程(Wroblewski et al.2005)。

在研究基因功能上瞬时转化可以作为稳定转化的很好的补充，目前实施瞬时转化主要的植物材料是烟草或者洋葱。洋葱作为单子叶植物，对于从单子叶植物中克隆的基因的亚细胞定位可信度可能更高，因此我们选择洋葱作为我们瞬时转化体系建立的对象。洋葱表皮细胞具有容易获得、单层细胞、透明且无叶绿体干扰等优点，是研究生理学活性、蛋白活性、细胞动力学、基因瞬时表达、蛋白亚细胞定位及蛋白与蛋白互作非常理想的实验材料(Scott et al.1999；Walter et al.2004；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010；Zhang et al.2011)。

基因枪法和农杆菌介导的转化方法是目前瞬时转化的主要方法。基因枪法受载体的限制较小并且可以用于单子叶植物和双子叶植物组织，在洋葱中常规的转化方法主要是应用基因枪法(Christou 1995；Eady et al.1996；Scott et al.1999；Arnim 2007；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010)。但是，利用基因枪法进行转化有转化效率低、转化过程昂贵并且受仪器设备及辅助材料的限制。

近年来，也有报道称用农杆菌介导的方法进行洋葱瞬时转化(Sun et al.2007；Xu et al.2014)。它的优点是只需要常规的菌株、载体以及培养基不需要昂贵的仪器设备和金粉等，并且操作简单，成本低，拷贝数低。但是目前的转化效率还不是很高，体系的应用上还没有蛋白与蛋白互作方面成功的报道。

技术实现要素：

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法。本发明要解决的技术问题是优化农杆菌介导的洋葱瞬时转化体系，提高转化效率。利用本发明体系首先可以快速的判断新构建的用于稳定转化的带有荧光蛋白标签的载体是否有活性，避免稳定转化的过程中浪费人力物力；同时还可以进行目标蛋白的亚细胞定位以及蛋白与蛋白的互作等工作，为基因功能的分析提供辅助手段。

本发明的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法通过以下技术方案来实现：将洋葱表皮细胞侵染在含有农杆菌的侵染培养基中，20～22℃侵染10～20分钟，光下培养24小时。

所述的侵染培养基是以MS培养基为基础，通过调节葡萄糖和蔗糖的含量，增加了农杆菌侵染液的渗透势；同时添加0.01％的Silwet L-77，增加了农杆菌在洋葱表皮上的富集，提高了转化效率。

所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法，包括以下步骤：

(1)取洋葱内表皮块；

(2)含有目标基因的农杆菌侵染培养基的配置：将活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中，28℃200rpm摇动培养过夜；将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中，28℃200rpm摇动45小时，OD₆₀₀＝0.5～0.8；将菌液4℃低温4000rpm离心6min后倒掉上清，用侵染培养基将菌体重悬致浓度OD₆₀₀＝0.3，添加Silwet L-77；

(3)洋葱表皮侵染：在无菌条件下，将洋葱内表皮块放到含有菌体的添加了Silwet L-77的侵染培养基中，轻轻晃动，侵染10～20min；侵染后将洋葱表皮靠近叶肉的一侧朝下放到共培养培养基上；共培养培养皿放到光下20±2℃24个小时。

步骤(1)具体为：将洋葱鳞茎，去除外层1～2层鳞叶，将洋葱鳞茎消毒后在超净工作台内用无菌水将鳞茎洗干净，纵切开洋葱鳞茎，取中层靠内的较肥厚的鳞叶，在这些鳞叶内部用解剖刀轻画1cm²的十字方块若干，撕下这些洋葱内表皮块。

所述洋葱鳞茎消毒是70～75％(体积浓度)的乙醇消毒。

步骤(2)中所述农杆菌菌株为EHA105或GV3101(来自中科院植物所景海春课题组)。携带与GUS、GFP或YFP等报告基因融合的外源基因导入洋葱表皮细胞。

步骤(2)中将活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中，体积比为1:100，YEB液体培养基含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素或者100μg/ml壮观霉素，100μM乙酰丁香酮；

将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中，体积比1:10；YEB液体培养基含有100μM乙酰丁香酮。

步骤(2)中用侵染培养基将菌体重悬致浓度OD₆₀₀＝0.3，所用的侵染培养基为高粱浸染培养基，侵染培养基中添加0.01％的Silwet L-77。

添加了Silwet L-77的高粱侵染培养基每L包括以下成分：MS培养基4.43g，葡萄糖36g，蔗糖68.5g，MES培养基0.5g，Silwet L-770.01％(体积百分比)，乙酰丁香酮100μM，pH 5.8。

步骤(3)中共培养培养基为高粱共培养培养基，每L包括以下成分：MS培养基4.43g，葡萄糖10g，蔗糖20g，MES培养基0.5g，琼脂8g,乙酰丁香酮100μM，pH 5.8

为了减少农杆菌对洋葱表皮细胞的侵害，使转化效率更加稳定，优化了步骤(2)中侵染培养基中菌体的浓度，选择侵染培养基菌体的浓度为OD₆₀₀＝0.3。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明的侵染培养基是以MS培养基为基础，通过调节葡萄糖和蔗糖的含量，增加了农杆菌侵染液的渗透势；同时添加0.01％的Silwet L-77，增加了农杆菌在洋葱表皮上的富集，提高了转化效率。

利用本发明体系首先可以快速的判断新构建的用于稳定转化的带有荧光蛋白标签的载体是否有活性，避免稳定转化的过程中浪费人力物力。

本发明不依赖于基因枪等昂贵的实验材料，成本低；转化过程简单快捷，全程仅需2～3天；不受例如烟草、拟南芥等需要种植后才能转化的植物材料的限制；转化效率高达90％以上；可以进行较为准确的亚细胞定位研究和蛋白与蛋白互作的研究，为基因功能的分析提供辅助手段。

附图说明

图1所示为实施例1和实施例2中所用载体构架；

图2所示为实施例3中所用载体构架；

图3所示为农杆菌介导的洋葱表皮瞬时转化程序；其中，a：新鲜鳞茎，b：将鳞茎纵切开，c：洋葱内表皮切1cm2小块，d：在离心管中对洋葱表皮进行侵染，e：共培养，f：将共培养后洋葱表皮放在载玻片上准备显微观察，标尺＝1cm；

图4所示为实施例1p3300-GFP绿色荧光的表达；其中，a：p3300-GFP绿色荧光图，b：明场，c：a与b叠加图，d：空白对照(未转化洋葱表皮细胞)，e：明场，f：d与e叠加图，标尺＝100微米；

图5所示为菌液浓度对转化效率的影响；

图6所示为CWIN10B-mCherry融合蛋白在洋葱表皮的亚细胞定位；a：p1300-CWIN10B-mCherry红色荧光蛋白(质壁分离图)，b：明场，c：a与b叠加图，d空白对照(未转化洋葱表皮细胞)，e明场，f：d与e叠加图；标尺＝100微米；

图7所示为利用洋葱表皮细胞检测CYCH与CDKD；2的互作；a：pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE蛋白与蛋白互作黄色荧光，b：明场，c：a与b叠加图，d：pSPYNE-YCHA/YNEE阴性对照，无互作黄色荧光，e：明场，f：d与e叠加。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实例1

农杆菌介导的洋葱表皮细胞亚细胞定位体系的优化

(1)选取生长旺盛，活力强的洋葱鳞茎，去除最外层1～2层鳞叶(图3a)，将洋葱鳞茎在70～75％乙醇中浸泡10分钟消毒，然后在超净工作台内用无菌水将鳞茎洗涤3-5次，用无菌解剖刀纵切开洋葱鳞茎(图3b)，取中层靠内的较肥厚的鳞叶，在这些鳞叶内表皮(凹面)用解剖刀轻画约1cm²的十字方块若干，撕下这些洋葱内表皮块(图3c)；

(2)以GFP为报告基因，优化转化体系。将GFP报告基因连入pCAMBIA3300载体中，构建表达载体pCAMBIA3300-ubi-gfp双元表达载体(图1)。将该载体导入农杆菌EHA105中，将经鉴定为阳性克隆并活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中(体积比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素、100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇过夜；将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中(体积比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇4-5小时，OD₆₀₀＝0.5～0.8；将菌液4℃低温4000rpm离心6min后倒掉上清，用侵染培养基SbIM、AtIM和TnIM(添加或不添加0.01％的Silwet L-77)(浸染培养基请见表1)将菌体重悬致浓度OD₆₀₀＝0.1、0.3和0.5。

(3)洋葱表皮侵染：在无菌条件下，将5-10块洋葱内表皮块放到含有菌体的不同的侵染培养基中(侵染液放在2ml离心管中)(图3d)，轻轻晃动，侵染10～20min。侵染后将洋葱表皮靠近叶肉的一侧朝下放到共培养培养基上(SbCOM)(图3e)。共培养培养皿放到光下20±2℃24个小时，将洋葱表皮在无菌水中清洗几遍，然后放到载玻片上，盖上盖玻片(图3f)，在激光共聚焦显微镜下观察结果如图4所示，洋葱表皮细胞有明显的绿色荧光表达(见说明书附图图4)。由图5柱状图我们可以看出，当菌液浓度为OD₆₀₀＝0.3时，转化效率高达92％以上，显著高于OD₆₀₀＝0.1时，与OD₆₀₀＝0.3时差异不显著(见说明书附图图5)。为提高转化效率，本发明优化了步骤(2)中侵染培养基的组成，所述农杆菌侵染培养基和共培养培养基见表1；IM侵染培养基是以MS培养基为基础，通过调节葡萄糖和蔗糖的含量，增加了农杆菌侵染液的渗透势；同时添加0.01％的Silwet L-77，增加了农杆菌在洋葱表皮上的富集，提高了转化效率(如表2所示)。

为了减少农杆菌对洋葱表皮细胞的侵害，使转化效率更加稳定，优化了步骤(2)中侵染培养基中菌体的浓度，选择侵染培养基菌体的浓度为OD₆₀₀＝0.3。

表1不同侵染培养基及共培养培养基(SbCOM)

注：SbIM(高粱侵染培养基)，SbIM+s(高粱侵染培养基添加了Silwet L-77)，SbCOM(高粱共培养培养基)，TnIM(烟草侵染培养基)，TnIM+s(烟草侵染培养基添加了Silwet L-77)，AtIM(拟南芥侵染培养基)，AtIM+s(拟南芥侵染培养基添加了Silwet L-77)。

表2不同侵染培养基及不同侵染时间对洋葱转化效率的影响

注：大写字母A-D表示转化效率在0.01显著水平上差异极显著，小写字母a-e表示转化效率在0.05水平上差异显著，利用SPSS13统计分析软件及Duncan方法对不同处理间转化效率进行显著性差异分析；+s：培养基中添加Silwet L-77。

由表格可知，高粱侵染培养基添加了Silwet L-77的转化效率高达90％,远高于其他侵染培养基,同时也远高于高粱侵染培养基未添加Silwet L-77的50～60％的转化效率。

实施例2

农杆菌介导的洋葱表皮细胞的转化方法应用于蛋白亚细胞定位的研究

(1)选取生长旺盛，活力强的洋葱鳞茎，去除最外层1～2层鳞叶(图3a)，将洋葱鳞茎在70～75％乙醇中浸泡10分钟消毒，然后在超净工作台内用无菌水将鳞茎洗涤3～5次，用无菌解剖刀纵切开洋葱鳞茎(图3b)，取中层靠内的较肥厚的鳞叶，在这些鳞叶内表皮(凹面)用解剖刀轻画约1cm²的十字方块若干，撕下这些洋葱内表皮块(图3c)；

(2)以mCherry为报告基因，将CWIN10B连入pCAMBIA1300-mCherry载体中，构建表达载体pCAMBIA1300-CWIN10B-mCherry双元表达载体(图1)。将该载体导入农杆菌GV3101中，将经鉴定为阳性克隆并活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中(体积比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇过夜；将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中(体积比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇4～5小时，OD₆₀₀＝0.5～0.8；将菌液4℃低温4000rpm离心6min后倒掉上清，用侵染培养基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)将菌体重悬致浓度OD600＝0.3。

(3)洋葱表皮侵染：在无菌条件下，将5～10块洋葱内表皮块放到含有菌体的不同的侵染培养基中(侵染液放在2ml离心管中)(图3d)，轻轻晃动，侵染10-20min。侵染后将洋葱表皮靠近叶肉的一侧朝下放到共培养培养基上(SbCOM)(图3e)。共培养培养皿放到光下20+2℃24个小时，将洋葱表皮在无菌水中清洗几遍，然后放到载玻片上，盖上盖玻片(图3f)，在激光共聚焦显微镜下观察，结果显示CWIN10B蛋白定位在细胞壁上(图6)。

该实施例说明了此方法可以快速的进行较为准确的基因亚细胞定位研究

实施例3

农杆菌介导的洋葱表皮细胞的转化方法应用于蛋白与蛋白互作的研究

(1)选取生长旺盛，活力强的洋葱鳞茎，去除最外层1～2层鳞叶(图3a)，将洋葱鳞茎在70～75％乙醇中浸泡10分钟消毒，然后在超净工作台内用无菌水将鳞茎洗涤3～5次，用无菌解剖刀纵切开洋葱鳞茎(图3b)，取中层靠内的较肥厚的鳞叶，在这些鳞叶内表皮(凹面)用解剖刀轻画约1cm²的十字方块若干，撕下这些洋葱内表皮块(图3c)；

(2)将CYCH和CDKD；2分别连入pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE载体中构成pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE载体，pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE空载作为阴性对照(图2)。将所有载体导入农杆菌EHA105中，将经鉴定为阳性克隆并活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中(体积比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇过夜；将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中(体积比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm摇4～5小时，OD₆₀₀＝0.5～0.8；将菌液4℃低温4000rpm离心6min后倒掉上清，用侵染培养基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)将菌体重悬致浓度OD₆₀₀＝0.3。

(3)洋葱表皮侵染：在无菌条件下，将5～10块洋葱内表皮块放到含有菌体的不同的侵染培养基中(侵染液放在2ml离心管中)(图3d)，轻轻晃动，侵染10～20min。侵染后将洋葱表皮靠近叶肉的一侧朝下放到共培养培养基上(SbCOM)(图3e)。共培养培养皿放到光下20±2℃24个小时，将洋葱表皮在无菌水中清洗几遍，然后放到载玻片上，盖上盖玻片(图3f)，在激光共聚焦显微镜下观察，结果表明转了pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE的洋葱表皮细胞在细胞核和细胞质中出现了强烈的黄色荧光，阴性对照中没有荧光出现(图7)。

该实施例证明了本发明技术方案可应用于较为准确的蛋白与蛋白互作的研究。