一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法与流程

文档序号:12108905阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,将洋葱表皮细胞侵染在含有农杆菌的侵染培养基中,20~22℃侵染10~20分钟,光下培养24小时。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)取洋葱内表皮块;

(2)含有目标基因的农杆菌侵染培养基的配置:将活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中,28℃200rpm摇动培养过夜;将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中,28℃200rpm摇动4~5小时,OD600=0.5~0.8;将菌液4℃低温4000rpm离心6min后倒掉上清,用侵染培养基将菌体重悬致浓度OD600=0.3,添加Silwet L-77;

(3)洋葱表皮侵染:在无菌条件下,将洋葱内表皮块放到含有菌体的添加了Silwet L-77的侵染培养基中,轻轻晃动,侵染10~20min;侵染后将洋葱表皮靠近叶肉的一侧朝下放到共培养培养基上;共培养培养皿放到光下20±2℃24个小时。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,步骤(1)具体为:将洋葱鳞茎,去除外层1~2层鳞叶,将洋葱鳞茎消毒后在超净工作台内用无菌水将鳞茎洗干净,纵切开洋葱鳞茎,取中层靠内的较肥厚的鳞叶,在这些鳞叶内部用解剖刀轻画1cm2的十字方块若干,撕下这些洋葱内表皮块。

4.根据权利要求3所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,所述洋葱鳞茎消毒是70~75%的乙醇消毒。

5.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,步骤(2)中所述农杆菌菌株为EHA105或GV3101。

6.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,步骤(2)中将活化一次的携带双元载体的农杆菌接种到10ml YEB液体培养基中,体积比为1:100,YEB液体培养基含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素或者100μg/ml壮观霉素,100μM乙酰丁香酮;

将菌液再次转接到新鲜的10ml YEB液体培养基中,体积比1:10;YEB液体培养基含有100μM乙酰丁香酮。

7.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,步骤(2)中用侵染培养基将菌体重悬致浓度OD600=0.3,所用的侵染培养基为高粱浸染培养基,侵染培养基中添加0.01%的Silwet L-77。

8.根据权利要求7所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,添加了Silwet L-77的高粱侵染培养基每L包括以下成分:MS培养基4.43g,葡萄糖36g,蔗糖68.5g,MES培养基0.5g,Silwet L-77 0.01%,乙酰丁香酮100μM,pH 5.8。

9.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法,其特征在于,步骤(3)中共培养培养基为高粱共培养培养基,每L包括以下成分:MS培养基4.43g,葡萄糖10g,蔗糖20g,MES培养基0.5g,琼脂8g,乙酰丁香酮100μM,pH 5.8。

10.如权利要求1所述的一种农杆菌介导的高效洋葱瞬时表达体系建立的方法在目标蛋白的亚细胞定位以及蛋白与蛋白的互作方面的应用。

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