一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。
【背景技术】
[0002] 1987年，Grimsley等[25]将玉米条斑病毒的cDNA通过农杆菌介导法成功感染了玉 米植株，首次证明了农杆菌可以侵染玉米；1991年Gould等 [26]通过农杆菌介导玉米茎尖分 生组织的遗传转化获得了阳性转基因植株；1996年Ishida等[12]用含超双元载体的根癌农 杆菌侵染玉米自交系A188的幼胚，得到5% -30%的转化率，并获得可育的玉米种子，这在 农杆菌介导玉米遗传转化的研宄历程中具有十分重要的意义；2002年Frame等 [27]用普通 双元载体建立了一套稳定的农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化系统，在同一时间，Zhao等[3] 也发表了类似的文章。农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的相继建立，为农杆菌介导法 的实际生产应用提供了充足的理论基础和事实依据，为农杆菌介导法的进一步发展打下了 坚实的基础。
[0003] 在目前的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法中，一种是在38°C热激较长 的时间，另一种是在较高的42°C热激较短的时间。具体步骤如下：
[0004] 第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5%有效氯的次氯酸钠 溶液（内含1-2滴tween 20)灭菌20min，每隔5分钟搅动一次。用无菌水冲洗2次后开始 剥胚；
[0005] 第二步：挑选1. 0-1. 5mm的白色略微有点透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养 基的1.5mL离心管里；
[0006] 第三步：用无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；
[0007] 第四步：热激前吸干原先的inf侵染液，用已经预热好的无菌inf侵染液（含有 IOOmM的AS)加入离心管中，并立即水浴热激；CK组常温处理，不进行热激；38度组放入 38°C水浴热激9分钟；42度组42°C水浴热激3分钟；热激后立刻冰浴1分钟降低温度；
[0008] 第五步：用无菌inf侵染液（含有IOOmM的AS)重悬后的0D550 = 0. 3的菌液在 20°C条件下侵染IOmin后吸干菌液盾片朝上摆到共培养培养基上；
[0009] 共培养3天后可使用⑶S染色等方法检测侵染效率。将幼胚继续诱导成的愈伤组 织，培育成为转基因植株。统计愈伤形成和获得植株数据。
[0010] 由后面的表2中可以看到，在38°C热激9分钟和在42°C热激3分钟均可显著提高 瞬时表达效率，但却会同时大大降低愈伤组织诱导率，因此，尽管这两种方法的转化率较之 室温条件下的方法具有一定提高，但是由于愈伤组织诱导率的下降，最终导致转化率提高 有限。
【发明内容】
[0011] 鉴于上述问题，本发明旨在提出一种能够显著提高转化率的提高农杆菌介导的玉 米遗传转化效率的方法。
[0012] 本发明的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法包括以下步骤：第一步：挑 选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5%有效氯的次氯酸钠溶液灭菌20分钟， 每隔5分钟搅动一次；用无菌水冲洗2次后开始剥胚；其中，所述次氯酸钠溶液含有1-2滴 tween 20 ;第二步：挑选1.0 -L 5mm的白色透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基的 1. 5mL离心管里；第三步：用所述无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；第四步：分别预热 两管热激液，第一热激液预热温度为38°C，第二热激液预热为42°C，并准备冰浴条件；第五 步：吸干所述离心管里的述无菌inf侵染培养基后，用所述的已经预热好的38°C无菌的第 一热激液加入离心管中，并将所述离心管立即放入38°C水浴热激8分钟；第六步：随后立刻 将带有所述幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，重新加入无菌inf侵染培养基 冲洗；第七步：再次吸干所述离心管里的所述无菌inf侵染培养基后，将所述的已经预热好 的42°C无菌的第二热激液加入到所述离心管中，并立即放入42°C水浴热激1分30秒；第八 步：将水浴温度调至20°C，使含有所述幼胚的第二热激液自然降温至20°C后，吸干离心管 中的液体；第九步：在所述离心管中加入用无菌inf侵染培养基重悬后的0D550 = 0. 3的 菌液，在20°C条件下侵染20分钟后吸干所述菌液，盾片朝上将所述幼胚摆到共培养培养基 上，共培养3天。
[0013] 优选地，所述第一热激液包含lg/L的NH4C1、0. 34g/L的MgS04、150mg/L的KC1、 l〇mg/L 的 CaCL2、3mg/L 的 FeS04、0. 5mol/L 的 NaH2P04、20g/L 的蔗糖、19. 52g/L 的 MES、 200 μ mol/L 的 AS、100mg/L 的 SM ;
[0014] 所述第二热激液包含l/2N6salts、N6维生素、2. Omg/L的2, 4-D、0. 115g/L的脯氨 酸、68. 4g/L 的鹿糖、36g/L 的葡萄糖、0· 5g/L 的 MES、0. lg/L 的肌醇、IOOmM 的 AS。
[0015] 优选地，所述无菌inf侵染培养基为pH 5. 2,且包含：l/2N6salts、N6维生素、 2. 0mg/L 的 2, 4-D、0. 7g/L 的脯氨酸、68. 4g/L 的鹿糖、36g/L 的葡萄糖、0· 5g/L 的 MES、0.1 g/ L的肌醇、IOOmM的AS。
[0016] 优选地，所述共培养培养基pH为5. 8,其包含：l/2N6salts、N6维生素、2. 0mg/L的 2, 4-D、0. 7g/L 的脯氨酸、30g/L 的蔗糖、0· 5g/L 的 MES、0. lg/L 的肌醇、0· 154g/L 的 DDT、 〇. 3g/L的半胱氨酸、0. 85mg/L的硝酸银、100 μ M的AS、8g/L的琼脂。
[0017] 本发明的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法通过多次热激和降温，使得 细胞每次需要承受的高温不是很长，但总体时间却足够长，所以，本发明的方法对愈伤组织 的活性影响不大，同时保证了热激提高农杆菌的转化效率。本发明的方法通过一定时间的 热激后冷却来使植物细胞更容易进入感受态的状态，使得植物细胞更容易接受外源的DNA。 本发明首次提出了四段式的热激法，首创了温差预处理法，利用两种不同热激温度和两次 降温的温差，大幅提高了遗传转化效率。
[0018] 说明书附图
[0019] 图 1 为 pCAMBIA3301-EPSPS 中 T-DNA 区段示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面，详细说明本发明的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。
[0021] 1植物材料
[0022] 以1. 0-1. 5mm的白色略微有点透明Hi- II玉米幼胚为受体材料。
[0023] 2农杆菌及质粒
[0024] 以根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为侵染菌株，由中国农 业大学提供；PCAMBIA3301-EPSPS为侵染质粒，由李敬娜 [71]构建，试验室保存。其中 PCAMBIA3301为常用载体，EPSPS为抗草甘膦筛选标记。pCAMBIA3301、EPSPS为公开序列。
[0025] pCAMBIA3301-EPSPS中T-DNA区段示意图如图1所示。
[0026] 3培养基配方 [0027]表 1
[0028]
[0029] 其中YEP是根癌农杆菌的培养液。
[0030] 本发明的方法如下：
[0031] 第1步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5%有效氯的次氯酸钠 溶液（内含1-2滴tween 20)灭菌20分钟，每隔5分钟搅动一次。用无菌水冲洗2次后开 始剥胚；
[0032] 第2步：挑选1. 0-1. 5mm的白色略微有点透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养 基的1.5mL离心管里；
[0033] 第3步：用无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；
[0034] 第4步：分别预热两管热激液，热激液1预热温度为38°C，热激液2预热42°C，并 准备冰浴条件。
[0035] 第5步：预热热激前吸干原先的inf侵染液，用已经预热好的38°C无菌热激液1加 入离心管中，并立即放入38°C水浴热激8分钟；
[0036] 第6步：随后立刻将带有幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，加入普通 inf培养基冲洗。
[0037] 第7步：吸干inf培养基后，再用已经预热好的42°C无菌热激液2加入离心管中， 并立即放入42 °C水浴热激1分30秒；
[0038] 第8步：调至20°C，使含有幼胚的热激液2自然降温至20°C后，吸干离心管中的液 体。
[0039] 第9步：加入用无菌inf侵染液重悬后的0D550 = 0. 3的菌液在20°C条件下侵染 20分钟后吸干菌液盾片朝上摆到共培养培养基上；
[0040] 共培养3天后可使用⑶S染色等方法检测侵染效率。将幼胚继续诱导成的愈伤组 织，培育成为转基因植株。统计愈伤形成和获得植株数据。
[0041] 表 2
[0042] 不同处理方法的幼胚瞬时表达率、愈伤组织诱导率及转化率数据
[0043]
[0044] 虽然，上述对照实验中，热激液1、热激液2的成分如表1中所示，热激液1和热激 液2均为无菌inf侵染培养基。
[0045] 由上表可以看出，较之现有技术的38°C -9分钟的方法和42°C -3分钟的方法的 愈伤组织诱导率（分别为27. 31 %和23. 69% )低于室温下方法时的愈伤组织诱导率（为 33. 64% )，本发明的方法的愈伤组织诱导率（41. 14% )高于室温下方法时的愈伤组织诱导 率，此外，在提高愈伤组织诱导率的同时，本发明的方法的瞬时表达效率（为75. 30% )并不 比现有技术的38°C -9分钟的方法和42°C -3分钟的方法的瞬时表达效率（分别为71. 11 % 和74. 48% )，因此，本发明的方法也具有显著高的转化