一种重组人胰岛素的工业制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体是指一种重组人胰岛素的工业制备方法。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的迅猛发展，基因工程重组人胰岛素面世，较动物来源胰岛素优势更加明显，与人体内胰岛素的序列完全一致，且纯度更高，含宿主蛋白少，安全无毒副作用。
[0003]现有的人胰岛素的制取方法，工序复杂，对原料及设备要求较高，无法适应批量化生产的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种重组人胰岛素的工业制备方法，简化工艺流程，提高生广效率，改进广品品质，适应工业制备需求。
[0005]本发明通过下述技术方案实现:一种重组人胰岛素的工业制备方法，包括以下步骤:
步骤SlOO:制备菌种；
步骤S200:培养菌种；
步骤S300:包涵体的收集；将培养的菌种在-20°C以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2-4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体；
步骤S400:RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2-1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05-0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液；
步骤S500:RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI复性液；
步骤S600:酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12终止反应并沉淀生成hi ；
步骤S700:hl的纯化；hl的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hi通过预置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hi进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10-20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；步骤S800:hl成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，-20°C以下冻干，得到hi成品；
所述步骤SlOO具体是指:
步骤SllO:以人胰腺CDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因；
步骤S120:从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE-40质粒；步骤S130:分别取出目的基因和pQE-40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和HindIII同时酶切并产生粘性末端； 步骤S140:在20°C以下，T4DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE_40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA ;
步骤S150:将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞Ml5 ；
所述步骤S200具体是指:
步骤S210:取出步骤SlOO中制备的菌种进行活化；
步骤S220:采用二级发酵方式，恒温振荡2-3h ；
步骤 S230:用 0.5mmol/L 的 IPTG 诱导 RRhPI/pQE40 E.coli M15 菌种表达 RRhPI。
[0006]进一步地，所述步骤S210具体是指:取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌种一环接种于PH值为6.8-7.6的培养基中，室温条件下以200-280rpm的速度进行振荡培养，通气量为1:1.3-1:1.6 ;所述培养基的主要成分为3-8g/L胰蛋白胨，l-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L 硫酸钱，2-3g/L 葡萄糖，2-3g/L 甘油，90-110mg/L 氨节青霉素，40_60mg/L卡那霉素。
[0007]进一步地，所述培养基的最优配比为5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸钱，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨节青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培养基用NaOH调节PH值至7.2。
[0008]进一步地，所述步骤S300中缓冲液A的主要成分为40-60mmol/L Tris-HCl,0.2-0.8mmol/L EDTA，40-60mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1-0.5mmol/L DTT ;所述缓冲液 A 的 PH值为 7.8-8.2 ο
[0009]进一步地，所述步骤S300中缓冲液A的主要成分为50mmol/L Tris-HCl, 0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl，5% 甘油，0.3mmol/L DTT ;所述缓冲液 A 的 PH 值为 7.9。
[0010]进一步地，所述步骤S400中缓冲液B的主要成分为0.1%-0.3%β-硫基乙醇，5-50mmol/L Tris-HCl，5-lOmol/L 尿素；所述缓冲液 B 的 PH 值为 7.8-8.2。
[0011]进一步地，所述步骤S400中缓冲液B的主要成分为0.2%β-硫基乙醇，30mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素；所述缓冲液B的PH值为8.0。
[0012]进一步地，所述步骤S400中缓冲液C的主要成分为40-70mmol/L Gly-NaOH,0.3%-0.5%的半胱氨酸；所述缓冲液C的PH值为9-10。
[0013]进一步地，所述步骤S500中缓冲液D的主要成分为40-70mmol/L Gly-NaOH,10-50mmol/L GSSG，10-50mmol/L GSH ;所述缓冲液 D 的 PH 值为 9-10。
[0014]进一步地，所述步骤S500中缓冲液D的主要成分为50mmol/L Gly-NaOH, 30mmol/L GSSG，30mmol/L GSH ;所述缓冲液 D 的 PH 值为 9.5。
[0015]本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果:简化工艺流程，提高生产效率，改进广品品质，适应工业制备需求。
【附图说明】
[0016]图1为本发明的工艺流程不意图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0018]实施例1:
本实施例的一种重组人胰岛素的工业制备方法，主要是通过下述技术方案实现:包括以下步骤:
步骤SlOO:制备菌种；
步骤S200:培养菌种；
步骤S300:包涵体的收集；将培养的菌种在-20°C以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2-4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体；
步骤S400:RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2-1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05-0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液；
步骤S500:RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI复性液；
步骤S600:酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12终止反应并沉淀生成hi ；
步骤S700:hl的纯化；hl的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hi通过预置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hi进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10-20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；步骤S800:hl成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，-20°C以下冻干，得到hi成品；
所述步骤SlOO具体是指:
步骤SllO:以人胰腺CDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因；
步骤S120:从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE-40质粒；步骤S130:分别取出目的基因和pQE-40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和HindIII同时酶切并产生粘性末端；
步骤S140:在200C以下，T4DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE_40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA ;
步骤S150:将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞Ml5 ；
所述步骤S200具体是指:
步骤S210:取出步骤S100中制备的菌种进行活化；
步骤S220:采用二级发酵方式，恒温振荡2-3h ；
步骤 S230:用 0.5mmol/L 的 IPTG 诱导 RRhPI/pQE40 E.coli M15 菌种表达 RRhPI。
[0019]实施例2:
本实施例在上述实施例的基础上做进一步优化，进一步地，所述步骤S210具体是指:取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌种一环接种于PH值为6.8-7.6的培养基中，室温条件下以200-280rpm的速度进行振荡培养，通气量为1: 1.3-1:1.6 ;所述培养基的主要成分为3-8g/L胰蛋白胨，l-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L硫酸钱，2_3g/L葡萄糖，2-3g/L甘油，90-110mg/L氨苄青霉素，40_60mg/L卡那霉素。本实施例的其他部分与上述实施例相同，故不再赘述。
[0020]实施例3:
本实施例在上述实施例的基础上做进一步优化，进一步地，所述培养基的最优配比为5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸钱，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨苄青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培养基用NaOH调节PH值至7.2。本实施例的其他部分与上述实施例相同，故不再赘述。
[0021]实施例4:
本实