专利名称：高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法
高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法。
背景技术：
小球藻是一种单细胞微藻，其含有丰富的氨基酸、蛋白质、脂肪酸及类胡萝卜素等生物活性物质。小球藻所含的类胡萝卜素以叶黄素为主，叶黄素具有抗氧化活性，能够预防癌症、心血管疾病和年龄相关黄斑变性等疾病。由于小球藻具有生长速度快、可异养培养、易于进行规模化培养和藻种改良等优点，利用小球藻合成叶黄素越来越受人们的关注。
透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种氧结合蛋白，在限氧条件下可以促进氧的运输并减少耗氧量，从而提高细胞的呼吸作用和代谢水平。目前，人们对透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)进行了大量研究，该基因已经在细菌、真菌和植物中成功表达。研究结果表明Vgb基因的表达能够促进细胞的生长、提高目的代谢物的产量和提高细胞的抗逆性。发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因小球藻的方法。
本发明提供的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻；
所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-985位核苷酸。
上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因以透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的形式导入目的小球藻。
所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子。
所述透明颤菌血红 蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。
上述方法中，所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻。
所述重组载体为将所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ;在本发明的实施例中，所述重组载体具体为将序列表中序列I所示的核苷酸插入PCAMBIA2301载体的Hind III和BamH I酶切位点间得到的载体。
上述方法中，所述重组载体通过重组菌导入目的小球藻；所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌具体为农杆菌LBA4404。
上述方法中，导入的方法包括如下步骤:用重组农杆菌侵染目的小球藻的原生质体；所述重组农杆菌为将所述重组载体导入农杆菌得到的。
上述目的小球藻为小球藻ST1002CGMCC N0.6951。上述生物量为藻体冷冻干燥后的干重由上述方法得到的转基因小球藻也是本发明保护的范围。小球藻ST1002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCN0.6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301。所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子。 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。本发明的第三个目的是提供一种重组菌。本发明提供的重组菌，为将上述的重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌具体为农杆菌LBA4404。上述的转基因小球藻、上述的重组载体或上述的重组菌在制备叶黄素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第四个目的是提供一种生产叶黄素的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:I)培养由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，收集藻液中的藻体，得到培养后转基因小球藻；2)将所述培养后转基因小球藻在无水乙醇中超声破碎，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ;3)将所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。上述方法具体如下:I)在FC培养基中培养(具体为28°C、180r/min摇床培养5天)由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，收集藻液中的藻体(具体为8000r/min离心收集lOmin)，得到培养后转基因小球藻；再将培养后转基因小球藻干燥后研磨为粉；2)将经过上述I)处理后的培养后转基因小球藻在无水乙醇中超声(超声功率210瓦，为连续超声温度35°C)破碎30min ;再加入20% (质量百分含量)KOH水溶液超声皂化(超声功率210瓦，为连续超声温度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；3)将溶液A加入二氯甲烷和蒸馏水萃取，收集二氯甲烷相，蒸发干燥二氯甲烷，即得到叶黄素。本发明的实验证明，本发明将颤菌血红蛋白编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的生物量和野生型小球藻相比提高了 38.81%，叶黄素含量和野生型小球藻相比提高了 5.93%，叶黄素产量和野生型相比提高了 47.19%。
图1为重组质粒pCAMBIA2301-vgb的构建过程示意图
图2为转vgb小球藻的表型鉴定结果
左图为小球藻原生质体与农杆菌共培养后涂布于筛选培养基有藻落长出，右图为小球藻原生质体未与农杆菌共培养涂布于筛选培养基没有藻落长出
图3为转Vgb小球藻在筛选培养基中进一步鉴定
图4为PCR验证转vgb小球藻中vgb基因的插入情况
图5为PCR验证转vgb小球藻中NPT II基因的插入情况
图6为转vgb小球藻和野生型小球藻的生物量示意图
图7为转vgb小球藻和野生型小球藻的叶黄素含量示意图
图8为转vgb小球藻和野生型小球藻的叶黄素产量示意图具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。
克隆载体pBluescript II SK+:Stratagene, Catalog Number#212205o
双兀载体pCAMBIA2301:CAMBIA, Canberra, Australia。
质粒pGAPZ a A:1nvitrogen, Catalog Number V205-20。
农杆菌菌株LBA4404:1nvitrogen, Catalog Number 18313-015
酶处理液:由溶质和溶剂组成；溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)，其中溶质及其终浓度如下:2% (质量百分比)纤维素酶(上海生工，CLS002610)，2% (质量百分比)蜗牛酶(上海生工,SB0870)和 0.2M KCl。
FC培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下:葡萄糖10g/L、胰蛋白胨2g/L、牛肉浸膏 lg/L、酵母浸膏 lg/L、FeSO4.7H20 2mg/L。
TYNG培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下:10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、0.2g/L 的 MgSO4.7H20，其余为水；pH7.5。
頂培养基:由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下=NaCl 0.15g/L、MgSO4.7Η200.25g/L、K2HP042.28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2.H2O0.078g/L、FeSO40.0025g/L、(NH4) 2S040.53g/L、葡萄糖 1.98g/L、甘油 0.54g/L、MES (2-吗啉乙磺酸)7.808g/L ；pH5.3。
筛选培养基由FC培养基、KC1、G418、氨苄青霉素、头孢霉素和水组成，KCl的浓度为0.2mol/L, G418的浓度为450ug/mL，氨苄青霉素的浓度为300ug/mL，头孢霉素的浓度为300ug/mL。
实施例1、重组质粒pCAMBIA2301-vgb的构建
一、重组质粒pBS-vgb的构建
( I)透明颤菌血红蛋白基因vgb的克隆
根据genebank公布的vgb基因序列(如序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸)，设计两端引物:
vgb-F:5，-GGAATTCATGTTAGACCAGCAAACC-3，；
vgb-R:5’-AACTGCAGTTATTCAACCGCTTGAGC-3’。
以序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸为模板,vgb_F和vgb-R为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性45s，56°C退火lmin，72°C延伸Imin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。得到44Ibp的PCR产物，即为vgb基因(具有序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸)。(2)用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切上述(I)得到的PCR产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切克隆载体pBluescript II SK+，回收296 Ibp载体骨架(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-vgb。二、重组质粒 pCAMBIA2301_vgb 的构建(I)启动子CAMV35S的获得设计两引物:CAMV35S-F:5’-CCCAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCA-3’ ；CAMV35S-R:5’ -GGAATTCAGTCCCCCGTGTTCTCT-3’。以质粒pCAMBIA2301 为模板，CAMV35S-F 和 CAMV35S-R 为引物，PCR 扩增，得至Ij538bpPCR产物，即为启动子CAMV35S。PCR 反应条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。`(2)用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切(I) PCR产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切上述一得到的重组质粒pBS_vgb，回收3402bp载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-CAMV35S-vgb。(5)终止子CYCl的获得以质粒pGAPZ a A为模板，CYC1-F和CYCl-R为引物，PCR扩增得到318bpPCR产物，即为终止子CYCl。设计两端引物:CYCl-F:5’-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ;CYCl-R:5’-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3’PCR 反应条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。(6)用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切(5)得到的PCR产物，回收酶切产物。(7)用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切(4)得到的重组质粒pBS-CAMV35S-vgb,回收 3940bp 载体骨架。(8)将步骤(6)的酶切产物和步骤(7)的载体骨架连接，得到重组质粒PBS-CAMV35S - vgb-CYCl。(9)用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切重组质粒pBS_CAMV35S - vgb-CYCl，回收1309bp酶切产物(vgb基因表达盒CAMV35S - vgb-CYCl，核苷酸序列为序列表中的序列O(10)用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切双元载体pCAMBIA2301，回收11608bp载体骨架。
(11)将步骤(9)的酶切产物和步骤(10)的载体骨架连接，得到重组质粒PCAMBIA2301-vgb。
重组质粒pCAMBIA2301_vgb的结构示意图及构建流程图见图1。
将重组质粒pCAMBIA2301-vgb送去测序，结果该质粒为将序列表中序列I所示的核苷酸插入PCAMBIA2301载体的Hind III和BamH I酶切位点间得到的载体。
序列表中序列I为vgb基因表达盒CAMV35S - vgb_CYCl，其中，序列表中序列I自5’末端第1-538位核苷酸为启动子CAMV35S，自5’末端第545-985位核苷酸为基因vgb，自5’末端第986-1309位核苷酸为终止子CYCl。
实施例2、转vgb小球藻鉴定及表型分析
—、转vgb小球藻的获得
采用农杆菌介导小球藻的转化，具体如下:
( I)小球藻原生质体的制备
小球藻ST1002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCN0.6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。
挑取小球藻ST1002 (CGMCC N0.6951 ;也称为野生型小球藻)单藻落接种于FC培养基中，28 °C摇床培养至藻体长出。
以1%的接种量转接于50mL新鲜的FC培养基，28°C摇床培养至对数期。
以4000rpm的转速4°C离心7min收集藻细胞，用遇冷的无菌水洗涤藻细胞一次后，用预处理剂(预处理剂由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液配制(pH5.8);所述溶质及其浓度为:50mmol/L EDTA, 25mmol/L DTT)处理 30min。
4000rpm的转速离心7min收集藻细胞，加入IOmL酶处理液，28 °C摇床消化14小时，得到小球藻原生质体。
(2)重组质粒PCAMBIA2301-Vgb通过电转化方法转化农杆菌菌株LBA4404，得到重组农杆菌 LBA4404/pCAMBIA2301-vgb (Hind III和 BamH I 酶切，得到 1309bp 的为阳性)。
(3)挑取重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA2301-Vgb至TYNG培养基中，28°C摇床培养至对数期。离心收集菌体，用诱导培养基IM培养基重悬，调整农杆菌浓度为0D_=0.6-0.8加入终浓度为150umol/L的乙酰丁香酮，25°C预诱导5小时，收集菌液。
(4)离心收集步骤(I)的原生质体，用诱导培养基頂培养基重悬后，加入步骤(3)得到的菌液中，25°C侵染24小时，得到藻体与农杆菌的共培养物。
(5)离心收集步骤(4)中的藻体与农杆菌的共培养物，涂布于固体的筛选培养基，28°C培养7天，有藻落长出，得到转vgb小球藻。
同时，以未与农杆菌共培养的小球藻原生质体做阴性对照，将其涂布于筛选培养基。
与农杆菌共培养的藻体涂布于筛选培养基后有藻落(即转vgb小球藻)长出(图2A),而未与农杆菌共培养的藻体涂布于筛选培养基后没有藻落长出(图2B)。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA2301转入野生型小球藻中，得到转空载体小球藻。
二、转vgb小球藻鉴定及表型分析1、二次筛选和表型鉴定将获得的转Vgb小球藻培养后在筛选培养基中划线，同时以野生型小球藻和转空载体小球藻做阴性对照。结果如图3所示，Vl至V7为转vgb小球藻藻株，WT为野生型小球藻藻株；可以看出，转vgb小球藻能够在筛选培养基上生长，而野生型小球藻不能生长。转空载体小球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。2、转vgb小球藻分子鉴定PCR验证外源基因在转vgb小球藻基因组中的整合情况，具体如下:提取转vgb小球藻和野生型小球藻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别用引物 vgb-F/vgb-R 和 NPT I1-F/NPT I1-R 进行 PCR 扩增。vgb-F:5’-GGAATTCATGTTAGACCAGCAAACC-3’ ；vgb-R: 5’-AACTGCAGTTATTCAACCGCTTGAGC-3’。NPT I1-F:5，-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3，；NPT I1-R:5’-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3’。
PCR 反应条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。取5uL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图4 (vgb基因片段PCR鉴定)和图5 (NPT II基因片段PCR鉴定)所示，其中，WT为野生型小球藻藻株、PC为阳性质粒pCAMBIA2301-vgb、Vl_V6为转vgb小球藻藻株；可以看出，转vgb小球藻的基因组能够扩增出约441bp vgb基因片段，而野生型小球藻的基因组中不能扩增出vgb基因片段；转vgb小球藻的基因组能够扩增出493bpNPT II基因片段，而野生型小球藻的基因组中不能扩增出493bpNPT II基因片段。结果表明，外源基因已经插入小球藻基因组中，进一步证明转vgb小球藻构建成功。转空载体小球藻采用上述方法鉴定，基因组中不能扩增出Vgb基因片段，但能够扩增出493bpNPT II基因片段。3、转vgb小球藻生物量的测定将V3、V4、V6的转vgb小球藻、转空载体小球藻和野生型小球藻以5%(体积百分含量)的量接种于含有IOOmL FC培养基的250mL三角烧瓶中，28°C、180r/min摇床培养5天，得到藻液。将藻液8000r/min离心IOmin收集藻体，除去上清液，藻体冷冻干燥后，称量干重即为生物量。结果如图6所示，转vgb小球藻V3、V4、V6的生物量和野生型(2.36g/L)相比显著提高，分别为 2.73g/L (藻液)、3.28g/L 和 3.26g/L。转空载体小球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。三、转vgb小球藻产生叶黄素含量的测定将上述二的3培养后收集的藻体:转vgb小球藻V4、转空载体小球藻和野生型小球藻研磨为粉状，准确称取0.05g转vgb小球藻粉、转空载体小球藻粉和野生型小球藻藻粉，加入2.5mL无水乙醇超声破碎30min (超声功率210瓦，为连续超声温度35°C)后，再加1.5mL20%K0H (质量百分含量)超声皂化(超声功率210瓦，为连续超声温度35°C)IOmin ;得到溶液A ;用二氯甲烧、蒸懼水各20mL萃取，5000r/min离心5min,弃去上层水相，收集二氯甲烷相，40°C低压旋转蒸发干燥，得到提取物。
提取物用色谱纯甲醇定容至5mL ;稀释5倍，过0.22um滤膜后进行HPLC检测。HPLC检测的色谱条件为:流动相为甲醇和水(体积比为95:5)，流速为0.8mL/min，进样量10uL，检测波长为444nm。
每个株系的小球藻取3株，实验重复三次，结果取平均值。
标准品为叶黄素标准品(美国Sigma公司，X6250)，其保留时间为9.2min。
转vgb小球藻中保留时间为9.2min的提取物为叶黄素。
叶黄素含量的标曲函数为y=184018x-8422.2 (R2=0.9824)，其中y为峰面积，X为叶黄素浓度，R2为拟合优度。
叶黄素含量结果如图7所示,转vgb小球藻V4的叶黄素含量为0.89mg/g (g为藻粉)，和野生型0.84mg/g相比略有提高，提高了 5.93%。
进一步分析每升藻液(野生型和转vgb小球藻每升藻液的干粉量不同，具体为如图6所示生物量；藻液的获取方式在实施例2的二的3。)中叶黄素的产量，结果如图8所示，转vgb小球藻V4的叶黄素产量为2.91mg/L，和野生型1.98mg/L相比提高了 47.19%。
转空载体小 球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。
权利要求
1.一种培育转基因小球藻的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻； 所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在在于:所述透明颤菌血红蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-985位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在在于:所述透明颤菌血红蛋白编码基因以透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的形式导入目的小球藻； 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒具体包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子； 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在在于: 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻； 所述重组载体为将所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在在于: 所述重组载体通过重组菌导入目的小球藻；所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。
6.由权利要求1-5所述方法得到的转基因小球藻。
7.一种重组载体，为将透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ； 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、透明颤菌血红蛋白编码基因和CYCl终止子； 所述透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。
8.一种重组菌，为将权利要求7所述的重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。
9.权利要求6所述的转基因小球藻、权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的重组菌在制备叶黄素中的应用。
10.一种生产叶黄素的方法，包括如下步骤: 1)培养由权利要求1-5所述方法得到的转基因小球藻或权利要求6所述的转基因小球藻，收集藻液中的藻体，得到培养后转基因小球藻； 2)将所述培养后转基因小球藻在无水乙醇中超声破碎，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ; 3)将所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。
全文摘要
本发明公开了一种高生物量和/或高叶黄素产量转基因小球藻及其制备方法。本发明提供了一种培育转基因小球藻的方法，为将透明颤菌血红蛋白编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的生物量和/或叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明将透明颤菌血红蛋白编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的生物量与野生型相比显著提高，提高了38.81%；叶黄素含量和野生型相比略有提高，提高了5.93%；叶黄素产量和野生型相比提高了47.19%，为高生物量和叶黄素产量小球藻。
文档编号C12N1/13GK103194459SQ20131012049
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者林祥志, 马瑞娟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所