专利名称：一种高效标记斑马鱼pgc的载体及转基因鱼的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于鱼类生物工程技术领域，本发明涉及一种高效标记斑马鱼PGC的载体，还涉及一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，还涉及该转基因斑马鱼在鱼类生物工程技术的用途。
背景技术：
作为遗传物质的传递者，鱼类原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGC)因其具有全能性已成为了鱼类生物工程技术的崭新的工具(Yoshizaki，G.,Takeuchi’Y-and Okutsu, T.(2007).^Germ cell in fish:basic biology and biotechnologicalapplications.^Tanpakushitsu Kakusan Koso52, 2067-2072.)。然而，缺乏良好的标记系统仍然是原始生殖细胞操作的一大障碍。因此，有必要将目前的分子遗传学技术运用到原始生殖细胞中，以便更好的分析生殖细胞发育过程中的分子机制和对其进行遗传操作。目前已经有一些研究报道建立了观察原始生殖细胞的方法，例如通过早期注射nosl3’ UTR调控荧光蛋白表达的mRNA可以快速简便地标记斑马鱼原始生殖细胞(Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B.and Raz, Ε.(2001).〃A zebrafish nanos-relatedgene is essential fo r the development of primordial germ cells."GenesDevl5, 2877-2885.)，但是利用这种方法荧光蛋白在发育早期并没有非常特异地在原始生殖细胞中表达，而且也不适用于在发育晚期观察原始生殖细胞。同时，研究者们也利用原始生殖细胞的marker基因vasa的启动子和3’ UTR驱使的GFP表达构建了转基因品
vas::EGFP(^Expression of a vas::EGFP transgen e in primordial germ cellsof the zebraf ish.^Mech Devl 16, 141-150 ; Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodi an, J.and Collodi, P.(2008)^ Zebrafish primordial germ cell cultures der ived fromvasa::RFP transgenic embryos."Stem Cells Devl7, 585-597.)。在 vas::EGFP 品系胚胎中，母源的vas::EGFP mRNA和VAS::EGFP蛋白在体节后主要在原始生殖细胞中聚集，且到受精后13天仍能能在原始生殖细胞中持续观察到GFP。利用该品系胚胎，Fan等(Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodian, J.and Collodi, P.(2008) ^Zebrafish primordialgerm cell cultures derived from vasa::RFP transgenic embryos.〃Stem CellsDevl7, 585-597)用流式细胞仪分离出荧光标记的斑马鱼体节期原始生殖细胞进行了体外培养。然而，在体节以前，母源表达荧光蛋白VAS::EGFP蛋白分布于整个卵裂球，并不特异于原始生殖细胞中(Kr ovel, A.V.and Olsen, L.C.(2002) "Expression of a vas::EGFPtransgene in primordial ger m cells of the zebrafish.〃Mech Devll6.141-150)。为了避免母源效应，vas::EGFP雄鱼与野生型雌鱼的杂交后代是从14-126天才开始表达EGFP,无法特异观察到早期原始生殖细胞(Wang, X.G., Bartfai, R., Sleptsova-Freidrich, 1.and Orban, L.(2007)〃The timing and extent of' juvenile ovary' phase arehighly variable during zebrafish testis differentiation.".Tournal of FishBiolog1TO, 33-44.)，所以利用vas::EGFP转基因品系并不利于胚胎发育早期操作原始生殖细胞。为了能在发育早期观察原始生殖细胞的迁移和分化，Blaser等人利用kop启动子和nosl3’ UTR构建了 Tg(kop:EGFP)品系能够在发育早期特异地在原始生殖细胞中表达EGFP (Blaser, H., Eisenbeiss, S., Neumann, M., Reichman-Fried, Μ., Thisse, B., Thi sse, C.and Raz, E.(2005)"Transition from non-motiIe behaviour to directed migrationduri ng early PGC development in zebraf ish.Cell Sci 118, 4027-4038)。由于kop启动子的母源表达效应和nosl3’ UTR的定位作用，Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFPmRNA从受精卵开始就定位于生殖质和原始生殖细胞中，从而可以利用Tg(kop:EGFP)从发育早期追踪观察原始生殖细胞的迁移和分化过程。然而由于母源性启动子kop表达的EGFP-UTRnoslmRN A的含量不高，导致EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便。Gal4/UAS系统在很多生物的特异组织中都具有转录放大作用(Halpern，Μ.Ε., Rhee, J., Gol I, Μ.G., Akitake, C.Μ., Parsons, Μ.and Leach, S.D.(2008) "Gal4/UAStransgenic tool s and their application to zebrafish.〃Zebrafish5, 97-110.)。利用Gal4/UAS系统控制基因表达的策略是首先利用组织特异性的启动子或增强子，将Gal4基因与启动子或增强子相连接，建立Gal4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制Gal4的表达。同时建立Gal4识别序列UAS (Upstream ActivationSequence)与靶基因相融合的转基因系。U AS-靶基因系中靶基因处于转录沉默状态，只有将Gal4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才可能产生在特异组织中表达靶基因的后代(Traven, A., Jelicic, B.and Sopta, Μ.(2006)^Yeast Gal4:a transcriptionalparadigm revisited."ΕΜΒ0 Rep7,496-499;Scheer, N.and Campos-Ortega, J.A.(1999)〃Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression i n thezebrafish."Mech Dev80.153-158)。近期，研究者们利用Gal4/UAS系统用于斑马鱼的启动子捕获研究，建立了能一些在斑马鱼组织中特异诱导表达荧光蛋白的转基因品系(Da vison, J.M., Akitake, C.Μ., Goll, M.G., Rhee, J.Μ., Gosse, N., Baier, H., Halpern, Μ.Ε., Leach, S.D.and Parsons, Μ.J.(2007)^Transactivation from Gal4_VP16transgenicinsertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish."DevBiol304, 811-824;Asaka wa, K., Suster, M.L., Mizusawa, K., Nagayoshi, S., Kotani, T.,Urasaki,A.,Kishimoto, Y., Hibi, M.and Kawakami, K.(2008)"Genetic dissection ofneural circuits by Tol2transpo son-mediated Gal4gene and enhancer trapping inzebrafish."Proc Natl Acad Sci U S A105, 1255-1260)。然而目前为止，仍没能构建出能在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达Gal4的转基因品系。同时，考虑到该系统的激活效率和细胞毒性，Distel等人将Gal4蛋白的DN A结合域与优化的单纯疱疹病毒蛋白VP16转录激活域TA4相融，同时连接上kozak翻译增强序列改造成的KalTA4蛋白，与4xUAS搭配使用可以有效的减少Gal4/UAS系统的细胞毒性和提高诱导激活效率(Distel，Μ.，ffullimann, Μ.F.and Koster, R.ff.(2009)"Optimized G al4genetics for permanent gen e expressionmapping in zebrafish.〃Proc Natl Acad Sci U S A.106.13365—13370)。因此，我们基于Gal4/UAS系统的转录放大作用，以mRFP作为报告基因，尝试在斑马鱼原始生殖细胞中特异高效诱导mRFP表达。首先，在斑马鱼中建立激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)。在这个转基因品系中，KalTA4转录激活因子特异的在原始生殖细胞中表达；其次建立效应转基因品系Tg (UAS: mRFP)。在这个品系中，mRFP是沉默的。当将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UASimRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP，从而特异,高效标记原始生殖细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体:pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP-SV40)，其序列为 SEQ ID N0.1 所示和 pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl，CMV:EGFP-SV40)，其序列为SEQ ID N0.2所示。将这两个载体分别导入到斑马鱼中，Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP,从而特异、高效标记原始生殖细胞。本发明还有一个目的在于提供一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法。该方法是基于诱导系统Gal4/UAS系统构建的，包含2套转基因品系:在原始生殖细胞中特异地表达KalTA4转录激活因子的激活转基因品系Tg(kop:KalTA4) ；mRFP表达沉默的效应转基因品系Tg (UAS:mRFP)。将Tg (kop: KalTA4)品系的雌鱼与Tg (UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中特异，高效表达mRFP以标记原始生殖细胞。本发明的最后一个目的是在于提供了这种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的用途。首先，本发明利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现了在斑马鱼原始生殖细胞中特异高效诱导基因表达调控技术。其次，利用Tg(kop:KalTA4)品系的转录放大功能在原始生殖细胞中高表达荧光蛋白，从而为研究体内观察，追踪原始生殖细胞发育提供了一个有力的平台，更重要的是，可以通过特异高效表达荧光蛋白分离出更早期的原始生殖细胞进行遗传操作。最后，利用Tg(kop:KalTA4)品系，可以通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。如果将包含表达框UAS:mRFP-UTRnosI的质粒作为构建转基因载体的基本骨架，并将转基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖细胞中表达mRFP的 胚胎培养，即在转基因鱼发育早期高效、快速筛选原始生殖细胞整合有外源基因的转基因胚胎。从而大大提闻转植基因在转基因鱼中的生殖传递效率，减少转基因鱼的筛选工作量。为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施:本发明的思路是:激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)的转基因载体有2个串联表达框:一个是由 kop 启动子(Blaser, H., Eisenbeiss, S., Neumann, M., Reichman-Fried,Μ.,Thisse, B.,Thisse, C.and Raz, E.(2005)"Transition from non-motiIe behaviourto directed migration during early PGC development in zebrafish.".T CellSci118,4027-4038)和 nosl3，UTR(Koprunner, M.，Thisse, C.，Thisse, B.and Raz, E.(2001)〃A zebrafish nanos-related gene is essential for the development ofprimordial germ cells."Genes Dev.15.2877-2885.)调控的 KalTA4 表达框，它们能指导KalTA4在原始生殖细胞中的特异表达，使用的KalTA4蛋白是酵母Gal4蛋白的DNA结合域与优化的单纯疱疹病毒蛋白VP16转录激活域TA4相融合的编码蛋白，同时在KalTA4序列5’端添加的Kozak序列增加KalTA4蛋白的翻译效率，经优化后KalTA4蛋白的诱导水平高且细胞毒性小。另一个是CMV启动和SV40poly (A)调控的EGFP的报告基因表达框，便于构建转基因品系的筛选。效应转基因品系Tg(UAS:mRF P)的转基因载体也包含了 2个串联表达框:一个是由UAS和nos 13 ’ UTR调控的mRFP表达框，另一个是CMV启动子和SV40poly (A)调控的EGFP的报告基因表达框,便于构建转基因品系的筛选。一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是:(I)设计基于Gal4/UAS系统利用mRFP标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因品系。策略图见图1所示:激活品系Tg(kop:KalTA4)可以在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达KalTA4转录因子；效应品系Tg (UAS:mRFP)中mRFP因受UAS和nosl3’UTR调控表达而处于沉默的状态。如果将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交，杂交胚胎原始生殖细胞中特异表达的KalTA4转录激活因子就能在原始生殖细胞中特异高效诱导表达 mRFP。(2) 构建激活品系Tg(kop:KalTA4)的转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGF P-SV40)，其序列为 SEQ ID N0.1 所示。(3)构建效应品系 Tg(UAS:mRFP)的转基因载体 pTol2 (UAS:mRFP_UTRnosl，CMV:EGFP -SV40)，其序列为 SEQ ID N0.2 所示。(4)显微注射。(5)Tg(kop:KalTA4)与 Tg(UAS:mRFP)转基因品系的筛选。(6)Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg (UAS:mRFP)雄鱼杂交获得特异、高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼Tg(kop:KalTA4，UASimRFP)。一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的用途，其步骤是:(I)激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达。I).KalTA4 探针制备。A.模板的制备和纯化。以质粒pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP-SV40)为模板，Probe-KalTA4_F 和T3-nosl3 ‘UTR-R (带T3启动子序列)为引物，PCR扩增出模板DNA，参照Axygen公司的PCRclean up试剂盒回收PCR产物，以其作为合成探针的探针。B.探针合成和回收。参照Promega的T3RNA聚合酶说明书转录合成RNA探针，并参照sigma spinpost-reaction chean-up columns 说明书回收探针。2).原位杂交检测检测激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA的表达。收集的4cell (a), shield (b),体节(c)及 Iday post-fertilization (dpf) (d)时期Tg(kop:KalT A4)品系早期胚胎，然后用KalTA4探针进行原位杂交检测(常规方法，Thisse, B., Heyer, V., Lux, A., Alunni, V., Degrave, A., Seiliez, 1., Kirchner, J., Parkhi 11, J.P.and Thisse, C.(2004)〃Spatial and temporal expression of the zebrafish genomeby large-scale in situ hy bridization screening.^Methods Cell Biol77, 505-519.)。原位杂交结果显示在胚胎早期发育KalTA4mRNA特异地在原始生殖细胞中表达:在二、四细胞期，母源性的KalTA4mRNA定位于分裂沟的边缘；在原肠过程中，KalTA4mR NA呈4簇在胚盘的边缘进 行迁移。体节期，KalTA4mRNA聚集成2簇左右对称分布于3_5体节处。发育至Idpf时，KalTA4mRNA呈左右对称全部迁移至背部的肠系膜处。
(2)过表达外源质粒诱导mRFP在原始生殖细胞中表达。在Tg(kop:KalTA4)品系胚胎I细胞期注射25ng/ylpTo 12 (UASimRFP-UTRnos I, CMV:E GFP-SV40)质粒，观察胚胎中的荧光表达。结果显示在体节早期，可以在原始生殖细胞中观察到非常特异地高表达的mRFP。随着发育的进行，在Idpf到9dpf，部分胚胎原始生殖细胞中仍能持续特异地高表达mRFP。这些结果表明利用Gal4/UAS系统，通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。(3) mRFP mRNA 在 Tg(kop:KalTA4)雌鱼与 Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中特异表达。分别收集4cell期，shield时期，体节早期和Idpf时期的Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎，用vasa和mRFP探针进行原位杂交。原位杂交的结果显示出Gal4/UAS系统胚胎中mRFP mRNA的表达模式与生殖细胞的标志基因vasa的表达模式相似。表明Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎中的mRFP都非常特异地表达于原始生殖细胞中。(4) Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中增强表达 mRFP mRNA。参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取胚胎总RNA,然后参见Invitrogen的反转录酶Superscript II说明书用Oligo (dT)合成cDNA的合成。参照Τ0Υ0Β0公司的SYBR Green Mix 说明书在 Applied Biosystems7900 仪器上进行 Real-Time PCR 后。然后运用Applied biosystems的SDS2.4软件分析数据，以β-actin基因的表达做内参,用2 —ΔΔ CT方法分析出EGFP和mRFP的相对表达量(常规方法，Livak, K.J.and Schmittgen, T.D.(2001)"Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the2(-Delta Delta C(T))."Method.Methods25,402-408.)。结果显示，Tg(ko p:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP mRNA 的表达水平是Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表达水平的300倍(P〈0.001)。表明Gal4 / UAS系统不仅能特异地在原始生殖细胞中诱导激活目的基因表达，更能高效地增强目的基因在原始生殖细胞中表达。(5) Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎的原始生殖细胞中特异高效表达m RFP。之前，Blaser等人构建的Tg(kop:EGFP)品系在发育早期能够用EGFP可以特异地标记原始生殖细胞。他们在共聚焦显微镜下通过观察EGFP追踪原始生殖细胞，并描绘出发育早期原始生殖细胞迁移过程中的细胞形态特征和调控原始生殖细胞迁移的分子机制(Blaser et al.，2005)。首先，我们观察了表达载体kop:EGFP-UTRnosl构建的转基因品系Tg(kop:EGF P)胚胎中EGFP表达模式。在我们实验室的荧光显微镜下，这些品系胚胎能在体节早期观察到原始生殖细胞特异的EGFP，但是荧光只能持续3天。而且EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便。然后，将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交，观察杂交胚胎 Tg (kop: KalTA4, UAS:mRFP)中的 mRFP 的表达模式。结果显示，在相同的显微镜下，Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:mRFP)品系的雄鱼杂交胚胎原始生殖细胞中高表达mRFP:shield时期可以观察到有微弱的mRFP，随着外包的进行荧光强度逐渐增加；胚胎发育至I天时，可以在原始生殖细胞处观察非常强的mR FP，并且荧光持续在原始生殖细胞中高表达；随后，在18dpf时，我们观察mRFP的表达在不同的鱼苗中发生了变化。部分胚胎的整个性腺组织中几乎都能观察到明亮的荧光，而其余的胚胎的性腺中仅少量的荧光表达；在25dpf时，仍能在部分的鱼苗中检测到少量的mRFP ;到了 30dpf，几乎所有鱼苗都不能在性腺中观察到mRFP。本发明与现有技术相比，具有以下优点:(I)本发明所述方法，构建了转基因品系Tg(kop:KalTA4)和转基因品系Tg(UASimRFP) 当将 Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与 Tg(UAS:mRFP)的雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能在杂交胚胎原始生殖细胞中诱导表达mRFP，从而特异、高效标记原始生殖细胞。(2)本发明利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼原始生殖细胞中诱导基因表达调控技术。可以利用Tg(kop:KalTA4)品系的转录放大功能在原始生殖细胞中高表达荧光蛋白，从而为研究体内观察，追逐原始生殖细胞发育提供了一个有力的平台。更重要的是，可以通过特异高效表达的荧光蛋白分离出更早期的原始生殖细胞进行遗传操作和研究。(3)利用Tg(kop:KalTA4)品系,可以通过注射质粒的方法特异、高效、持续地标记原始生殖细胞。如果将包含表达框UAS:mRFP-UTRn0sl的质粒作为构建转基因载体的基本骨架，并将转基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖细胞中表达mRFP的胚胎培养，即在转基因鱼发育早期高效、快速筛选原始生殖细胞整合有外源基因的转基因胚胎。从而大大提闻转植基因在转基因鱼中的生殖传递效率，减少转基因鱼的筛选工作量。
图1为一种基于Gal 4/UAS系统标记斑马鱼原始生殖细胞的策略示意图。a:Tg(kop:KalTA4)品系载体示意图；b:Tg(UAS:mRFP)品系载体示意图；c:Tg(kop:Kal TA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交后，原始生殖细胞特异的转录因子KalTA4 激活 UAS 表达 mRFP。图2为一种构建的Tg(kop:KalTA4)品系与Tg (UAS:mRFP)品系示意图。a,b:构建的Tg(kop:KalTA4)品系与Tg(UAS:mRFP)品系泛表达EGFP的荧光图。图3为一种Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎中的KalTA4mRNA表达模式示意图。收集的4cell(a), shield(b),体节(c)及 ldpf(d)时期 Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎用KalTA4探针检测。图4 为在 Tg(kop:KalTA4)胚胎中直接注射质粒 pTol2 (UAS:mRFP_UTRnosl，CMV:EGFP-S V40)就可以特异，高效，持续的标记原始生殖细胞。pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)质粒简写为 UAS:mRFP_UTRnosl。从体节期(a), I天(b), 3天(c)到9天(d)时mRFP都特异地在原始生殖细胞中高表达。图5为一种原位杂交检测Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP mR NA的时空表达模式示意图。野生型斑马鱼胚胎中原始生殖细胞的特异marker基因vasa的表达模式(a_e)和Tg(kop:K alTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP mRNA的表达模式(f-j)。分别收集 4 细胞期时(a，f，k), sphere 时期(b, g, I), shield 时期(c，h，m),体节期(d, i, η)和Idpf (e, j, ο)的胚胎分别用vasa和mRFP探针检测。图6 为 Real-Time PCR 检测 Tg(kop:KalTA4)雌鱼与 Tg (UAS:mRFP)雄鱼的杂交胚胎中mRFP mRNA表达水平相对于Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表达水平示意图。图7为一种Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中荧光表达示意图。(a-d)Tg(kop:EGFP)品系胚胎中从体节早期(a), Idpf (b), 3dpf (C)持续表达微弱的 EGF P，但是在 9dpf 不能观察到 EGFP(d)。(e_l)Tg(kop:KalTA4)雌鱼与 Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交胚胎中mRFP的表达。从s h i e I d时期能够观察到原始生殖细胞中特异表达mRFP(e，e，)。从Idpf (f, f’ ),3dpf(g，g，)到9dpf(h，h’)，都能在原始生殖细胞中持续观察到明亮的mRFP。在18dpf时，mRFP的表达在不同的鱼苗中发生了变化。少数胚胎的整个性腺组织中几乎都能观察到明亮的荧光(i，i’)，大部分胚胎的性腺中仅少量的荧光表达(j，j’ );在25(^^时，仍能在部分的鱼苗中检测到少量的mRFP(k，k’ );到了 30dpf，几乎所有鱼苗都不能在性腺中观察到mRFP(l，I’)。
具体实施例方式本发明实施例中的方法未经特别说明，均为本领域技术人员熟知的常规方法，具体可参考《分子克隆实验指南》(第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)。本发明中所用的生物试剂如未经特别说明，均来源于Fermantas公司。实施例1:一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是:·
1.制备基于Gal4/UAS系统利用mRFP标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因品系，策略图见图1所示。然后设计扩增转基因载体中各个片段所需要的引物。引物序列如下表所示:
权利要求
1.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体，其特征在于，转基因载体pTo12 (kop: KaITA4-UTRnos I, CMV:EGFP_SV40)，其序列为 SEQ ID N0.1 所示。
2.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体，其特征在于:转基因载体pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)，其序列为 SEQ ID N0.2 所示。
3.一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，其步骤是: (.DTg(kop:Kal7 必转基因品系的制备 通过显微注射仪和显微注射法将含转基因载体导入斑马鱼受精卵中，转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将杂交胚胎培养于28°C培养24hr，在荧光解剖镜下筛选出发出绿色荧光的胚胎继续培养，建立纯系Tg(kop:KeilTA4)； 所述的转基因载体 pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)其序列为 SEQ IDN0.1所示； (2)Tg(UAS:mRFP)转基因品系的制备 通过显微注射仪和显微注射法将转基因载体导入斑马鱼受精卵中，转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将杂交胚胎培养于28° C培养24hr，在荧光解剖镜下筛选出能发出绿色荧光的胚胎继续培养，建立纯系Tg(UAS:mRFP)； 所述的转基因载体pTol2(UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)其序列为 SEQ ID N0.2所示； ⑶Tg(kop:KalTA4)雌鱼与雄鱼杂交 将构建的纯合子 汉印..心77 必雌鱼与雄鱼杂交，获得一种特异高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼Tg(kop:KalTA4，UAS:mRFP)。
4.一种权利要求3所述的高效 标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法所制备的转基因鱼在鱼类生物工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途。利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼原始生殖细胞中诱导基因表达调控技术。首先分别构建激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)和效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)。然后将Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交就能获得高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼。这种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼在鱼类生物工程具有广泛应用。
文档编号A01K67/027GK103224955SQ20131016918
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月9日 优先权日2013年5月9日
发明者孙永华, 熊凤, 魏志强, 朱作言 申请人:中国科学院水生生物研究所