专利名称：一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复合多糖的制备方法，具体地说是指一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法。
背景技术：
近年来随着人们对多糖研究的深入，发现多糖具有相当多的生理功能，如免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血活性、降血糖、降血脂、抗缺氧等。多糖来源广泛，大多源于动物、植物、微生物和海藻中。不同的多糖具有不同的生物活性，但一般来说，真菌多糖具有较高的抗肿瘤活性，高等植物多糖具有较好的免疫促进作用。因此近年来真菌多糖与植物多糖逐渐受到重视。其中裂褶菌
coimune Fr.)多糖、燕麦多糖越来越受到市场的青睐,在医药市场、保健品市场、化妆品市场前景广阔。然而裂褶菌 子实体的培养，需要至少二至三个月；培养至采收耗时耗力，野外采集更为困难；源于子实体的多糖提取也工艺复杂，成本高昂。因此目前多利用液态发酵培养菌丝体生产多糖，以深层培养方式制造菌丝体居多。菌丝体经初步扩大，培养后，经由小到大的发酵罐逐级连续培养，借此大量生产。而不同的微生物在发酵过程中，需要均衡的营养，合适的碳氮比、温度、PH、搅拌速率、溶氧才能快速的繁殖产生代谢产物，且生产不同的代谢产物上述条件也不尽相同，不同的代谢产物需要不同的生产条件与外部营养环境。一般情况下，发酵产物还会有不理想的颜色与气味，影响最终产品的质量品相。其次，因真菌菌丝体在深层培养时生长较慢，过程中遭遇污染的机会也会增加，造成损失，因此液体菌种的质量，以及接种量都将影响最终产品的质量及发酵成败。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，本制备方法通过一次发酵便能够得到同时具有裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖优点的复合多糖，且生产周期短、工艺简单、成本低、气味小、色素低。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其中，包括以下步骤:步骤一:菌种活化:将裂褶菌接种到PDA平板培养基上进行复壮活化培养，得到平板菌
种；
步骤二:一级菌种的培养:在发酵罐中，将培养好的平板菌种，接种到种子培养基中，在摇床上培养，得到一级菌种；
步骤三:二级菌种的培养:在发酵罐中，将一级菌种接种于种子培养基中，在摇床上培养，得到二级菌种；步骤四:菌种的液体发酵:在发酵罐中，将二级菌种接种到基础培养基上，匀速搅拌、发酵，检测还原糖，直到还原糖的含量为O，发酵结束，得到发酵醪；
步骤五:提取与纯化:在发酵醪中加入1.5倍体积的水，在97°C至98°C的温度下水提2h至4h，经离心后得到上清液，上清液经吸附树脂脱色后，得到裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖。上述的步骤一中的PDA平板培养基的组成为:每升PDA平板培养基中含有马铃薯20 g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁5g,蛋白胨5g,琼脂20g,其余为自来水。上述的步骤二平板菌种的接种量为每IOOmlPDA平板培养基中接种两块0.5cm2的平板菌种。上述的步骤二中一级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。上述的步骤三中一级菌种的接种量为10%。上述的步骤三中二级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。上述的种子培养基的组成为每千克种子培养基中含有葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，酵母膏3g，其余为自来水。上述的步骤四中二级菌种的接种量为10%。上述的步骤 四中发酵醪的发酵温度为27°C至28°C，发酵时间为120h至168h，搅拌速度为180rpm。上述的基础培养基的组成为每千克基础培养基中含葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，牛肉膏4.5g，碳酸钙3g，燕麦麸5g，其余为自来水。本发明的方法能廉价快速的获得高质量的裂褶菌胞外多糖；通过配方改良，减小气味，降低色素，减少其他代谢产物的生成，生产周期也将大大缩短。同时在基础培养基中添加燕麦麸，利用温和的发酵条件，利用微生物法提取出其中包含的燕麦多糖；减少纯化学方法提取燕麦多糖的能源消耗与多糖损失，以及其他化学试剂的添加，将增加多糖的利用度，减少杂质；并且节省了利用燕麦提取燕麦多糖的一整套设备费用，降低成本，减少开支。获得的发酵产品，裂褶菌胞外多糖与燕麦复合多糖将兼顾较高的抗肿瘤活性与较好的免疫促进作用，同时具有多方面的皮肤健康促进效应，实现一次发酵得到具备多种功能的复合多糖。
图1是本发明的流程图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其中，包括以下步骤:
步骤一:菌种活化:将裂褶菌接种到PDA平板培养基上进行复壮活化培养，得到平板菌种；
步骤二: 一级菌种的培养:在发酵罐中，将培养好的平板菌种，接种到种子培养基中，在摇床上培养，得到一级菌种；
步骤三:二级菌种的培养:在发酵罐中，将一级菌种接种于种子培养基中，在摇床上培养，得到二级菌种；
步骤四:菌种的液体发酵:在发酵罐中，将二级菌种接种到基础培养基上，匀速搅拌、发酵，检测还原糖，直到还原糖的含量为O，发酵结束，得到发酵醪；
步骤五:提取与纯化:在发酵醪中加入1.5倍体积的水，在97°C至98°C的温度下水提2h至4h，经离心后得到上清液，上清液经吸附树脂脱色后，得到裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖。实施例中，步骤一中的PDA平板培养基的组成为:每升PDA平板培养基中含有马铃薯20 g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁5g,蛋白胨5g,琼脂20g,其余为自来水。实施例中，步骤二平板菌种的接种量为每IOOmlPDA平板培养基中接种两块0.5cm2的平板菌种。实施例中，步骤二中一级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。实施例中，步骤三中一级菌种的接种量为10%。实施例中，步骤三中二级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。`实施例中，种子培养基的组成为每千克种子培养基中含有葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，酵母膏3g，其余为自来水。实施例中，步骤四中二级菌种的接种量为10%。实施例中，步骤四中发酵醪的发酵温度为27°C至28°C，发酵时间为120h至168h，搅拌速度为180rpm。实施例中，基础培养基的组成为每千克基础培养基中含葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g,硫酸镁2.4g，牛肉膏4.5g，碳酸钙3g，燕麦麸5g，其余为自来水。下面结合流程图对本发明的方法作进一步阐述，
步骤一:菌种活化:按每升PDA平板培养基中含有马铃薯20 g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁5g，蛋白胨5g，琼脂20g，其余为自来水的组成配置PDA平板培养基，将配置完的PDA平板培养基在121 °C的温度下进行20min的灭菌处理，灭菌处理后将PDA平板培养基进行分装，然后将裂褶菌接种到PDA平板培养基上进行复壮活化培养，得到平板菌种，并对平板菌种的4°C的温度下进行保种处理。步骤二:一级菌种的培养:在3L的摇瓶中按照每千克种子培养基中含有葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，酵母膏3g，其余为自来水的组成配置种子培养基，将配置完的种子培养基在121°C的温度下进行20min的灭菌处理，灭菌处理后将种子培养基进行分装，然后将步骤一中制得的平板菌种按照10%的接种量将平板菌种接种到种子培养基上，接着将接种了平板菌种的种子培养基放到转速为180 rpm的摇床上进行培养，培养温度控制在27°C至28°C，培养时间为60h至72h，培养得到一级菌体。步骤三:二级菌种的培养:在30L的发酵罐中，在接种前先为发酵罐进行空消处理，然后将在4°C的温度下存放不到48h的一级菌体安装10%的接种量接种到种子培养基中，此处的种子培养基与步骤二中的种子培养基组成相同，接着将接种了一级菌种的种子培养基放到转速为180 rpm的摇床上进行培养，培养温度控制在27°C至28°C，培养时间为60h至72h，培养得到二级菌体；为了保持菌种的活性，步骤二中制得的一级菌体在4°C的温度下存放超过48h的需要再次经过活化后才能进行接种。步骤四:菌种的液体发酵:在500L的发酵罐中，同样地，在接种前先为发酵罐进行空消处理，按照每千克基础培养基中含葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，牛肉膏
4.5g,碳酸I丐3g,燕麦麸5g,其余为自来水的组成配制基础培养基,并对制得的基础培养基进行实消灭菌处理，然后将步骤三中制得的二级菌种按照10%的接种量将二级菌种接种到基础培养基上，接着将接种了二级菌种的基础培养基在180 rpm的匀速搅拌下发酵，发酵温度为27°C至28°C，发酵时间为120h至168h，在发酵的过程中进行还原糖的检测，当检测得出的还原糖数值大于0，则继续发酵6h，直到还原糖数值为O则停止发酵，得到产物发酵醪；在基础培养基中添加燕麦麸，利用温和的发酵条件，可以利用微生物提取出其中包含的燕麦多糖；减少纯化学方法提取燕麦多糖的能源消耗与多糖损失，以及其他化学试剂的添加，将增加多糖的利用度，减少杂质；而燕麦麸为工业下脚料，属于资源回首利用，绿色环保，节约成本。步骤五:提取与纯化:将发酵醪稀释，按照发酵醪与水的体积比1:1.5往发酵醪中添加水，此时多糖浓度> 3g/L，然后在97°C至98°C的温度下水提2h至4h，接着在5000rpm的转速下离心20min，得到上清液；对上清液进行去蛋白处理，在ph4.5至5.0的酸性环境下，静置0.5h至1.5h,然后再在5000rpm的转速下离心20min,得到收集液,再利用吸附树脂的吸附作用对收集液进行脱色处理，最终得到裂褶菌胞外多糖与燕麦复合多糖，所制得的产品浓度可达8g/L ;利用吸附树脂脱色，避免了活性炭脱色可能带来的悬浮微粒，降低了生产成本，简化处理工艺，利于大规模工业化生产。本发明的方法能廉价快速的获得高质量的裂褶菌胞外多糖；通过配方改良，减小气味，降低色素，减少其他代谢产物的 生成，生产周期也将大大缩短；获得的发酵产品，裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖将兼顾较高的抗肿瘤活性与较好的免疫促进作用，同时具备多方面的皮肤健康促进效应，实现一次发酵得到多种功能的复合多糖。
权利要求
1.一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:包括以下步骤: 步骤一:菌种活化:将裂褶菌接种到PDA平板培养基上进行复壮活化培养，得到平板菌种； 步骤二:一级菌种的培养:在发酵罐中，将培养好的平板菌种，接种到种子培养基中，在摇床上培养，得到一级菌种； 步骤三:二级菌种的培养:在发酵罐中，将所述的一级菌种接种于种子培养基中，在摇床上培养，得到二级菌种； 步骤四 :菌种的液体发酵:在发酵罐中，将所述的二级菌种接种到基础培养基上，匀速搅拌、发酵，检测还原糖，直到还原糖的含量为O，发酵结束，得到发酵醪； 步骤五:提取与纯化:在发酵醪中加入1.5倍体积的水，在97°C至98°C的温度下水提2h至4h，经离心后得到上清液，所述的上清液经吸附树脂脱色后，得到裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖。
2.根据专利要求I所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤一中的PDA平板培养基的组成为:每升PDA平板培养基中含有马铃薯20 g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁5g，蛋白胨5g，琼脂20g，其余为自来水。
3.根据专利要求2所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤二平板菌种的接种量为每IOOmlPDA平板培养基中接种两块0.5cm2的平板菌种。
4.根据专利要求3所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤二中一级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。
5.根据专利要求4所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤三中一级菌种的接种量为10%。
6.根据专利要求5所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤三中二级菌种的培养温度为27°C至28°C，培养时间为60h至72h，摇床的转速为180rpm。
7.根据专利要求6所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的种子培养基的组成为每千克种子培养基中含有葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，酵母膏3g，其余为自来水。
8.根据专利要求7所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤四中二级菌种的接种量为10%。
9.根据专利要求8所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的步骤四中发酵醪的发酵温度为27°C至28°C，发酵时间为120h至168h,搅拌速度为180rpm。
10.根据专利要求9所述的一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其特征是:所述的基础培养基的组成为每千克基础培养基中含葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g,硫酸镁2.4g，牛肉膏4.5g，碳酸钙3g，燕麦麸5g，其余为自来水。
全文摘要
本发明公开了一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法，其通过将裂褶菌接种到PDA平板培养基上进行复壮活化培养，得到平板菌种；接着将平板菌种接种到种子培养基中培养得到一级菌种；再将一级菌种接种于种子培养基中，培养得到二级菌种；然后将二级菌种接种到基础培养基上，发酵得到发酵醪；最后对发酵醪进行提取与纯化得到的复合多糖；所述的种子培养基的组成为每千克种子培养基中含有葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.4g，酵母膏3g，其余为自来水；所述的基础培养基的组成为每千克基础培养基中含葡萄糖50g，磷酸二氢钾5g,硫酸镁2.4g，牛肉膏4.5g，碳酸钙3g，燕麦麸5g，其余为自来水。
文档编号C12P19/04GK103160550SQ20131012010
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者徐宝军 申请人:徐宝军