专利名称：一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵工艺及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种柽柳核纤孔菌多糖的发酵エ艺及其在卷烟中的应用。
背景技术：
目前已知的天然多糖化合物约300多种，如真菌多糖、植物多糖、动物多糖、藻类多糖、细菌多糖等，其中关于真菌多糖的研究是目前的热·点之一。柽柳核纤孔菌多糖是从真菌发酵液中分离出的，具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物活性，真菌多糖现已被开发成多种药物和功能性食品添加剤。卷烟中添加一定的香料成分可以改善其吸食品质，从柽柳核纤孔菌丝体和发酵液中提取的多糖均具有极强烈的抑制癌细胞活性，抗氧化活性和免疫调节功能。真菌多糖作为烟草添加剤，经高温裂解或梅拉德反应将会产生一定的香气。柽柳核纤孔菌属于真核生物域，菌物界，真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，木层孔菌属，宽棱木层孔菌。子实体小至中等大，木质至木质，无柄侧生或半平伏。菌盖扁平，黄褐色至深灰褐色，后期变为灰黒色，有较宽的同心环棱。可供药用，有文献报道称柽柳核纤孔菌有止血、止痛和防治痔疮的作用，但未见胞外多糖的报道。目前已知的天然多糖化合物约300多种，如真菌多糖、植物多糖、动物多糖、藻类多糖、细菌多糖等，其中关于真菌多糖的研究是目前的热点之一。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的，具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物活性，因其进入体内后不会被消化、分解、吸收，能够和细胞膜上的受体结合，从而能发生药理活性，现已被开发成多种药物和功能性食品添加剤。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵柽柳核纤孔菌产胞外多糖及其在卷烟中的应用。本发明的技术方案是一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，氮源为5. 2^5. 4g/L胰蛋白胨，碳源为6(T65 g/L蔗糖，接种量为3、％，起始pH为8，温度22 28で，转速为120 180转/分钟，发酵10 15天。所述的柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，优选氮源为5. 24 g/L胰蛋白胨，碳源为64. 09 g/L蔗糖，接种量为4%，起始pH为8，温度25で，转速为150转/分钟，发酵12天。—种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. οΓο. 1%。所述的柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数优选为O. 04、. 06%。本发明的有益效果本发明柽柳核纤孔菌胞外多糖得率达到O. 58 g/L以上。柽柳核纤孔菌胞外多糖加入到烟丝中间去，增加烟草加香的效率，以提高烟草的品质，降低有害物质。柽柳核纤孔菌胞外多糖不仅具有一定的减害，降低卷烟毒性的作用，而且具有生津降刺，改善ロ感，提高吸食品质的作用。
具体实施例方式实施例I
一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，氮源为5. 2 g/L胰蛋白胨，碳源为60 g/L蔗糖，接种量为3 %，起始pH为8，温度22で，转速为120转/分钟，发酵10天。一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为0.01%。实施例2
一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，氮源为5. 4 g/L胰蛋白胨,碳源为65 g/L鹿糖，接种量为5%，起始pH为8，温度28で，转速为180转/分钟，发酵15天。
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一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. 1%。实施例3
一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，氮源为5. 2^5. 4 g/L胰蛋白胨，碳源为6(Γ65g/L蔗糖，接种量为3 5%，起始pH为8，温度22 28 V，转速为120 180转/分钟，发酵10 15天。一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. οΓο. 1%。实施例4
一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，氮源为5.24 g/L胰蛋白胨，碳源为64. 09 g/L蔗糖，接种量为4%，起始pH为8，温度25 V，转速为150转/分钟，发酵12天。一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数优选为O. 04 %。本发明菌株为柽柳核纤孔菌，菌株保藏编号WDCM133，购买自荷兰真菌多样化中心。I.所用培养基PDA固体培养基葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，2%琼脂；改良PDA固体培养基250g/L土豆，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%琼脂；基础培养基葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L ;液体种子培养基(基础培养基)葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L。2.柽柳核纤孔菌发酵时间的确定
斜面菌种培养配制改良的固体培养基，分装试管，灭菌后制备斜面，划线接种柽柳核纤孔菌后，于26°C培养4天，冷冻保藏即为柽柳核纤孔菌株菌种。从保存菌株的试管中，使用接种钩在试管斜面取出O. 5平方厘米的ー小块，接种到PDA固体平板中。接种时要使接种块上包含尽量少的培养基，ー个平板接两块，放入恒温培养箱，26°C培养7天。使用直径O. 5cm的打孔器，从固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体，接种于液体种子培养基中(250ml三角瓶，50毫升培养液)，在26°C，150r/min条件下培养4d ;然后以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养，每两天測定一次菌丝和EPS含量，确定柽柳核纤孔菌最佳发酵时间为12d。
3.分离纯化
柽柳核纤孔菌发酵结束后，将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液，发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5，然后加入4倍体积的无水こ醇，4°C过夜。IOOOOr/min离心lOmin，得沉淀为粗多糖；称取O. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸馏水，用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量。Sevag法脱蛋白称取Ig的粗多糖样品，室温下加入50mL蒸懼水溶解,加入1/4体积的氯仿一正丁醇(预先配制成体积比为4 I混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振摇30 min后,经离心机1000r/min离心5 min,然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿一正丁醇溶液，重复上述过程，共计重复二次。用硫酸-苯酚法对胞外多糖进行检测。纯化出的胞外多糖成分用旋转蒸发仪浓缩至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制柽柳核纤孔菌胞外多糖纯品，真空冷冻干燥保存。4.精制柽柳核纤孔菌发酵多糖的抗氧化性的測定方法· (l)2ml多糖溶液及2ml浓度为0. lg/Ι的DPPH 50%こ醇溶液先后加入同一试管中，摇匀，25°C放置lh，以50%こ醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度Ai。(2) 2ml浓度为O. lg/1的DPPH 50%こ醇溶液及2ml蒸馏水混合，摇匀，25°C放置Ih,以50%こ醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度Ao。(3) 2ml多糖溶液及2m 50%こ醇混合，摇匀，25°C放置lh，以50%こ醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度Aj。根据下列公式计算多糖对DPPH的清除率，即 清除率=[I-(Ai-Aj)/ Ao] X 100%
式中=Ai为加入抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；Ao为未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Aj为多糖溶液在測定波长时的吸光度。引入Aj是为了清除多糖溶液本身颜色对測定的干扰。清除率越大，抗氧化活性越高。测试结果为柽柳核纤孔菌多糖对DPPH自由基的清除率明显；在3 g/Ι的时候达到34. 66%。5.精制柽柳核纤孔菌胞外多糖在烟气中转移率的測定
称取0. Ig精制EPS溶于IOmL蒸馏水中，配成10mg/mL精制EPS储备液；取不同体积精制胞外多糖储备液(并加蒸馏水补充到0. 5mL，注射进散花成品烟中，使烟支中胞外多糖含量分别达到烟支质量的0. 02%,0. 04%,0. 06%,0. 08%,0. 1%，并做注射0. 5mL蒸馏水的空白对照，每组10支；放入恒温恒湿箱(温度22°C，湿度60%)平衡48 h ;然后用吸烟机对烟支进行抽吸；将抽吸后的剑桥滤片放入150mL三角瓶中，加入50mL无水こ醇超声lh，倒掉こ醇，然后加入50mL无水こ醇超声0. 5h,倒掉こ醇,再加入50mL蒸懼水超声两次,每次Ih,合并滤液，用硫酸-苯酚法測定多糖含量，计算其在烟气中转移率在2. 3% 3. 3%之间变动，确定了柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟中使用的可行性。转移率=(实验组剑桥滤片上多糖量-对照组剑桥滤片上多糖量)/多糖添加量。多糖在烟气中的转移率随其在多糖中浓度的増加而增加，在多糖添加量为0. 36 mg/支时，转移率为I. 58%，在多糖添加量为I. 44%吋，转移率为0.48 mg/支。而多糖添加量超过I. 43%达到0.60 mg/支时，多糖在烟气中的转移率为I. 63%。6.精制柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟中的感官评价 表I 柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟的感官评价结果
权利要求
1.一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，其特征在干氮源为5.2、. 4 g/L胰蛋白胨，碳源为60 65 g/L蔗糖，接种量为3 5%，起始pH为8，温度22 28で，转速为120 180转/分钟，发酵1(Γ15天。
2.根据权利要求I所述的柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵エ艺，其特征在于氮源为5.24 g/L胰蛋白胨，碳源为64. 09 g/L蔗糖，接种量为4%，起始pH为8，温度25で，转速为150转/分钟，发酵12天。
3.一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，其特征在于将柽柳核纤孔 菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中 的添加质量分数为O. οΓο. 1%。
4.根据权利要求3所述的柽柳核纤孔菌胞外多糖的的应用，其特征在于将柽柳核纤孔菌胞外多糖添加在卷烟中，柽柳核纤孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O.04、. 06%O
全文摘要
本发明公开了一种柽柳核纤孔菌胞外多糖的发酵工艺，氮源为5.2~5.4g/L胰蛋白胨，碳源为60~65g/L蔗糖，接种量为3~5%，起始pH为8，温度22~28℃，转速为120~180转/分钟，发酵10~15天。本发明柽柳核纤孔菌胞外多糖得率达到0.58g/L以上。柽柳核纤孔菌胞外多糖加入到烟丝中间去，增加烟草加香的效率，以提高烟草的品质，降低有害物质。柽柳核纤孔菌胞外多糖不仅具有一定的减害，降低卷烟毒性的作用，而且具有生津降刺，改善口感，提高吸食品质的作用。
文档编号C12R1/645GK102690849SQ20121019784
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者杨琛琛, 毛多斌, 耿卢靖, 袁鹭, 许春平 申请人:郑州轻工业学院