一株产抗肿瘤活性胞外多糖的植物乳杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株产抗肿瘤活性胞外多糖植物乳杆菌。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌是一种兼性厌氧异型发酵乳杆菌，广泛存在各种食品中，如蔬菜，肉， 鱼类和乳制品等。同时也常见于健康人体的肠道中，每克健康人群粪便中平均含有10 7-109 个植物乳杆菌，对于维持人体肠道微生态平衡，促进人体健康具有重要作用。但目前植物乳 杆菌的诸多功能及其人体作用机制并不清楚，明确其代谢产物如胞外多糖的功能，是确定 菌株生物活性和开发功能性食品的基础。
[0003] 乳酸菌胞外多糖是菌株生长代谢过程中分泌到胞外的大分子多糖。可作为增稠 剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂应用到食品、医药、石油化工以及生化产品等 领域。胞外多糖还具有多种生理活性，包括降血压、降胆固醇，抗氧化、抗溃疡、抗病毒、改善 肠道微生态环境和增强人体免疫力等。将产胞外多糖菌株加入到乳制品中作为发酵或辅助 发酵菌株，可有效改善发酵乳品的质构、口感、流变学特性和风味等指标，还可进一步提高 产品的营养保健作用。我国的乳酸菌胞外多糖研究起步较晚，与世界发达国家还存在差距， 已知具有明确生物活性的乳酸菌胞外多糖较少。
[0004] 藏灵姑是我国青海、西藏等地区的传统发酵乳制品，有着长时间的食用历史，其中 含有丰富的乳酸菌和酵母等微生物资源。近年的研究也表明，藏灵姑发酵食品具有降压，降 月旨，调整肠道微生态平衡等多种作用。藏灵姑发酵乳的黏稠特性也表明其中可能含有微生 物分泌的增稠大分子。因此如何从中筛选产胞外多糖乳酸菌，开发自主产权、功能明确的具 有健康促进作用的菌株对挖掘传统乳制品的生物活性，并在此基础上开发功能性食品具有 重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YWll。
[0006] 本发明提供的物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)YWll，其保藏号CGMCC N0.11863。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种制备胞外多糖的方法。
[0008] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的植物乳杆菌（Lactobaci llus plantarum)，收集发酵液，得到胞外多糖。
[0009] 上述方法中，在收集发酵液后，还包括如下步骤：
[0010] 1)用三氯乙酸水溶液与发酵液混匀，反应，收集反应液中的上清液；
[0011] 2)将所述上清液与无水乙醇混匀，静置，收集沉淀；
[0012] 3)将所述沉淀溶于水中，收集大于8000Da的产物，得到胞外多糖。
[0013] 由上述方法制备的胞外多糖也是本发明饱和的范围。
[0014] 上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培 养液或上述的胞外多糖在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也是本发明饱和的范围。 [0015] 上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培 养液或上述的胞外多糖在制备抑制肿瘤细胞生长产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0016] 上述应用中，所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞生长产品。 [00?8]本发明提供的产品，其活性成分为上述的植物乳杆菌（L a c t 〇 b a c i 11 u s plantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或上述的胞外多糖。
[0019] 上述产品中，所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
[0020] 上述产品为药物。
[0021] YW11于2015年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称0610：，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为0610：勵.11863，分类 命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 〇
[0022] 本发明的实验证明，本发明发现了一株新的植物乳杆菌，将其发酵收集胞外多糖， 检测胞外多糖能够抑制结肠癌细胞HT-29的生长，对HT-29移植瘤有明显的抑制作用，且对 荷瘤裸鼠体重、肝脏指数、肾脏指数和心脏指数均没有显著影响，可显著降低荷瘤裸鼠血清 中谷草转氨酶(AST)和肌酐(Cr)的水平，恢复谷丙转氨酶(ALT)和尿素氮(BUN)至正常水平， 提高荷瘤裸鼠血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)的数目，同时提高荷瘤裸鼠血清中超氧 化物歧化酶(S0D)活性，降低丙二醛(MDA)水平，因此证明，植物乳杆菌YW11的胞外多糖具有 较好的抗肿瘤活性，且对机体无毒，可开发为具有潜在健康功效食品或辅助药物用于治疗 结肠癌。
【附图说明】
[0023] 图1为不同浓度胞外多糖的肿瘤抑制效果。
[0024]图2为YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠血清生化指标的影响。
[0025] 图3为YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠血清中S0D活性(A)和MDA水平(B)的影响。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]实施例1、乳杆菌YW11的获得
[0029] 一、乳杆菌YW11的分离、纯化
[0030]取5g待分离藏灵姑样品加入45mL无菌生理盐水中，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓 度，取50yL稀释后的菌液涂布于MRS琼脂平板，于37°C厌氧培养72h。挑取平板上生长的乳酸 菌典型单菌落(圆形，中等大小，凸起，微白色边缘整齐)于MRS琼脂培养基上反复划线，直至 获得纯培养物为止，得到纯化单菌落YW11。
[0031] 二、乳杆菌YW11的鉴定 [0032] 1、表型鉴定
[0033]挑取上述一分离得到的YW11单菌落，在MRS培养基中培养，取菌液，涂布于MRS琼脂 平板，于37°C厌氧培养48-72h，形成乳酸菌典型单菌落（圆形，中等大小，凸起，微白色边缘 整齐）。
[0034] 2、生理生化鉴定
[0035]挑取上述一分离得到的YW11单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，其中革兰 氏染色阳性，细胞形态为杆状或链杆状，同时过氧化氢酶试验为阴性的菌株，初步鉴定为乳 杆菌。
[0036] 3、API 50 CH鉴定
[0037] 将活化好的上述一分离得到的YW11菌液稀释到适宜浓度，涂布于MRS琼脂平板上， 于37°C培养48h，用无菌牙签挑取菌株单菌落接入API 50 CH液体培养基中制成菌悬液，再 接入到API 50 CH鉴定试剂条中，37°C厌氧培养48h，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结 果，将结果输入梅里埃公司的鉴定软件API LAB PLUS(BioM6rieux，France)中进行判定。
[0038]根据下表1中的糖代谢图谱，鉴定菌株YW11为植物乳杆菌。
[0039] 表1植物乳杆菌YW11的API 50 CH检测结果
[0040]
[004,j
[0042] 4、16S rDNA鉴定
[0043] 提取菌株YW11的基因组DNA进行片段扩增。采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物， 正向引物：A27F 5' -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，反向引物:A1495R 3' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5'，1 · 5%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物委 托北京鼎国生物有限公司进行测序，将测序结果(序列1)与NCBI数据库中的核酸序列进行 比对。结果显示YW11菌株与NCBI数据库中KM265361等植物乳杆菌的16S rDNA序列相似度超 过 99 %。
[0044] 经过上述鉴定，YW11为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 〇
[0045] YW11于2015年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称0610：，地