专利名称：苹果多糖、其制备方法及在防治肿瘤转移药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防及抑制肿瘤转移的药物技术领域，具体涉及一种苹果多糖、 其制备方法及在抑制肿瘤转移药物中的应用。
背景技术：
Galectin-3属于半乳糖凝集素家族成员，广泛存在于正常细胞，在多种肿 瘤细胞高表达，在癌症转移及肿瘤浸润期明显升高。Galectin-3的最大特点是 能与含有半乳糖残基的配体结合。体内许多癌基因如MUC1，癌胚抗原如Tn抗 原都带有半乳糖残基,均能与galectin-3结合从而促进肿瘤转移。在结肠癌中， 受感染的细胞失去调控生长的能力，在某些位点形成了肿瘤。当癌细胞进入血 液后，粘液素可形成保护膜，阻止癌细胞扩散成为肿瘤。但是肿瘤细胞表面高 表达的galectin-3会与形成粘液素的一类基因MUC1结合，破坏保护膜，从而 使肿瘤细胞突破屏障，形成转移。Galectin-3与肿瘤转移相关的另外一个因素 在于galectin-3与层粘蛋白[laminin]的特异性结合，使高表达galectin-3 的肿瘤细胞随着血液与层粘蛋白结合，粘附在某个组织实现肿瘤浸润。而 galectin-3的外源性配体能够竞争性地抑制galectin-3与其内源性配体结合， 从而抑制galectin-3与诸如MUC1或laminin的结合，达到抑制肿瘤转移的目 的，因此galectin-3外源性配体具有重要作用。
肿瘤转移是肿瘤引起死亡的最主要原因，但是抗肿瘤转移药物非常缺乏， 尤其在现有药物中，抑制肿瘤转移的化疗药物副作用严重，病人难以耐受；各 种化疗药物相互的配合，协同作用并不理想；病人长期服用一种或多种药物一 方面难以耐受，另一方面肿瘤对化疗药物易产生耐药性。
目前仅有来源于美国红桔的修饰果胶(MCP)可靶向galectin-3，但由于 其来源有限，制作成本高，难以被广泛应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种作为预防和抑制肿瘤转移药物使用的改构苹
果多糖(MAP)，目的之二是提供上述苹果多糖的制备方法，目的之三是提供上 述苹果多糖在制备预防和抑制肿瘤转移药物中的应用，以填补抗肿瘤转移药物 的严重短缺。
本发明提供如下的技术方案
一种苹果多糖，由下述的方法制备而成，包括下述步骤(1)获得苹果粗
多糖；(2)降低酯化度，使酯化度小于20%后再通过凝胶层析或分子量截流， 获得分子量5 15kDa的苹果多糖。
上述步骤(1)中，是取搾汁的苹果渣，经水煮醇沉，反复冻融除蛋白， 活性炭脱色，获得苹果粗多糖；上述步骤(2)中，将粗多糖采用甲醇皂化(1N NaOH， 24小时)，或者通过硼氢化钠还原后；再通过碱(pH=9-10)与酸(pH二3-5) 水解后，或者经过果胶酶(PH=4-5)水解，使酯化度小于20%后，再通过凝胶 柱层析或分子量截流，获得目标苹果多糖。
一种苹果多糖的制备方法，依次包括下述步骤(l)获得苹果粗多糖；(2) 降低酯化度，使酯化度小于20%;再通过凝胶层析或分子量截流进行透析，获 得分子量5 15kDa的苹果多糖。
上述苹果多糖在制备预防及抑制肿瘤转移药物中的应用。 我们从苹果中提取分离、改构的苹果多糖组分(Apple Polysaccharide, AP)，分子量为5 15kDa，主要单糖组分为半乳糖和葡萄糖，可以特异性地与 galectin-3结合，作为galectin-3的外源性配体用于预防及对抗肿瘤转移。 动物实验表明，苹果多糖可显著抑制肿瘤的转移。
本发明的优点在于
1、 苹果资源丰富，且本发明提供的制备方法简单易操作，适用于大规模工 业化生产。
2、 本发明制备的苹果多糖，经分离纯化、结构改造，其主链结构以半乳糖
为主链，其支链主要为葡萄糖，不仅用于抗肿瘤转移，而且具有多糖的免疫调 节作用，与其他化疗药物同服，可以减轻化疗药物的副作用，提高患者的耐受 性。
3、安全可靠，经毒理实验等证实，本发明制备得到的苹果多糖无毒副作用， 可长期服用，避免化疗药物引起的严重副作用。
附图是MAP对FITC-Gal进入SW-1116细胞的竞争性拮抗作用。
具体实施例方式
以下描述涉及本发明抗肿瘤转移药物的制备方法及高表达galectin-3的 SW-1116结肠癌细胞与苹果多糖亲和力的实验结果，以及对结肠癌移植小鼠肺 转移的治疗作用。需要说明的是本发明药物的制备方法并不局限于以下述实施 例。
实施例l:
步骤(1):制备苹果粗多糖取榨汁的苹果渣，粉碎，乙醇回流3次，每 次8小时，残渣采用水回流3次，每次4小时，收集回流液，浓縮，乙醇沉淀， 反复冻融除蛋白，活性炭脱色，透析，浓縮，冻干，获得。
步骤(2):将15g苹果粗多糖加2mol/LNa0H的甲醇溶液，强力搅拌，60-80 r加热回流4-6h，冷却至室温，加入浓盐酸调pH值至3，强力搅拌，50-70°C 加热回流7-10h，减压蒸除溶剂，浓縮混悬液加适量蒸馏水至全溶，移至透析 袋(截流分子量8000)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内液颜色不再变化停 止透析，浓縮后冷冻干燥24h，得13.6g，为浅褐色粉末。HPLC检测酯化度小 于20%。
将水解后的苹果多糖加3N NaOH的水溶液，37"C搅拌过夜，冷却至室温， 乙醇沉淀，加入3N盐酸调pH值至3， 37t:搅拌过夜，调pH值至中性，减压蒸 除溶剂得浓縮混悬液。将浓縮混悬液加适量蒸馏水溶解，移至透析袋(截流分 子量30Q0)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内液颜色不再变化为止，浓縮后
冷冻干燥24h，得浅黄色粉末，采用凝胶柱分离获得分子量范围为5000-15000Da 的目标多糖。 实施例2:
步骤(1):制备苹果粗多糖取搾汁的苹果渣，粉碎，乙醇回流2次，每
次10小时，残渣通过水回流3次，每次3.5小时，收集回流液，浓縮，乙醇沉
淀，反复冻融除蛋白，活性炭脱色，透析，浓縮，冻干，获得。
步骤(2):将15g苹果粗多糖加2mol/LNa0H的甲醇溶液，强力搅拌，60-80 。C加热回流4-6h，冷却至室温，加入浓盐酸调pH值为3，强力搅拌，50-70°C 加热回流7-10h，减压蒸除溶剂，浓縮混悬液加适量蒸馏水至全溶，移至透析 袋(截流分子量8000)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内液颜色不再变化停 止透析，浓縮后冷冻干燥24h，得13.6g，为浅褐色粉末。HPLC检测酯化度小 于20%;
取水解后的苹果多糖在枸橼酸缓冲液(pH=4-5)中加入果胶酶，5(TC搅拌 4-6h，冷却至室温，减压蒸除溶剂得浓縮混悬液。将浓縮混悬液加适量蒸馏水 至全溶，移至透析袋(截流分子量3000)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内 液颜色不再变化停止透析，浓縮后冷冻干燥24h，得浅棕黄色粉末，采用凝胶 柱分离获得分子量范围为5000-15000Da的目标多糖。
实施例3:
步骤(1):制备苹果粗多糖取搾汁的苹果渣，粉碎，乙醇回流3次，每 次7小时，残渣通过水回流3次，每次4.5小时，收集回流液，浓縮，乙醇沉
淀，反复冻融除蛋白，活性炭脱色，透析，浓縮，冻干，获得。
步骤(2):将2g苹果粗多糖分批加入400mL 0. 5M的HCl/咪唑溶液(pH二7)， 强力搅拌至溶液各相均匀，称取10g NaBH4少量多次加入到上述溶液中，室温 下强力搅拌4h，加入25 mL乙酸终止反应，继续搅拌30min后加入足量无水乙 醇出现胶状沉淀，过滤，60%乙醇和5%HC1洗涤沉淀2次，60%乙醇洗涤沉淀2 次，足量无水乙醇再次沉淀，减压抽滤至干，6(TC烘箱干燥过夜，得干燥粉末
1.62g，为改性苹果多糖。HPLC检测酯化度小于16呢。
将还原后的苹果多糖加3N NaOH的水溶液，37。C搅拌过夜，冷却至室温， 乙醇沉淀，加入3N盐酸调pH值为3， 37。C搅拌过夜，调pH值至中性，减压蒸 除溶剂得浓縮混悬液。将浓縮混悬液加适量蒸馏水溶解，移至透析袋(截流分 子量3000)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内液颜色不再变化为止，浓縮后 冷冻干燥24h，得浅黄色粉末。采用分子量15000Da的膜包截流分子量大于 15000Da的苹果多糖，滤液浓縮、冻干、获得。
实施例4:
步骤(1):制备苹果粗多糖取榨汁的苹果渣，粉碎，乙醇回流3次，每 次9小时，残渣通过水回流2次，每次4小时，收集回流液，浓縮，乙醇沉淀， 反复冻融除蛋白，活性炭脱色，透析，浓縮，冻干，获得。
步骤(2):将2g苹果粗多糖分批加入400mL 0. 5M的HCl/咪唑溶液(pH二7)， 强力搅拌至溶液各相均匀，称取10g NaBH4少量多次加入到上述溶液中，室温 下强力搅拌4h，加入25mL乙酸终止反应，继续搅拌30min后加入足量无水乙 醇出现胶状沉淀，过滤，60%乙醇和5%HC1洗涤沉淀2次，60%乙醇洗涤沉淀2 次，足量无水乙醇再次沉淀，减压抽滤至干，6CTC烘箱干燥过夜，得干燥粉末 1.62g，为改性苹果多糖。HPLC检测酯化度小于16。/。。
将还原后的苹果多糖加3N NaOH的水溶液，37。C搅拌过夜，冷却至室温， 乙醇沉淀，加入3N盐酸调pH值为3， 37-C搅拌过夜，调pH值至中性，减压蒸 除溶剂得浓縮混悬液。将浓縮混悬液加适量蒸馏水溶解，移至透析袋(截流分 子量3000)内，以蒸馏水为透析外液，至透析内液颜色不再变化为止，浓縮后 冷冻干燥24h，得浅黄色粉末。采用分子量15000Da的膜包截流分子量大于 15000Da的苹果多糖，滤液浓縮、冻干、获得。
本发明并不仅局限于说明书中所举的实施例，本发明的药物剂型可以是片 剂、胶囊等各种口服使用的剂型。
本发明产物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用通过下面的实验数据说明 (1) 苹果多糖与galectin-3的亲和力测定
修饰的苹果多糖(MAP)与荧光标记的半乳糖(FITC-Gal)与高表达 galectin-3的SW-1116结肠癌细胞孵育1. 5小时，Elisa检测细胞内药量，结 果如图l:随着药物浓度增加，SW-1116结肠癌细胞内荧光强度明显增加，而采 用MAP与FITC-Gal共孵育后，MAP显著阻止了 FITC-Gal通过galectin-3进入 细胞的量，说明MAP与FITC-Gal对galectin-3有竞争性地作用。
(2) 苹果多糖(MAP)抑制肿瘤转移的作用 采用SW-1116细胞悬液皮下接种裸鼠，当肿瘤生长至直径约1.5cm时，取材切
成1.5咖3小块，移植于另外裸鼠右侧背部近腋部皮下。肿瘤接种1周后给予MAP 治疗，l次/天，共60天。肿瘤接种9周后可形成70%的肺转移，而MAP可显著降低 小鼠的肺转移，降低死亡率(参见下表)。
苹果多糖(MAP)对肿瘤转移的防治作用(『10， Y± s)
组别药物剂量转移率
mg/kg/d
对照组0—
模型组07/10
MAP1006/10
MAP2003/10
MAP4001/10
权利要求
1、一种苹果多糖，由下述的方法制备而成，所述制备方法包括下述步骤(1)获得苹果粗多糖；(2)降低酯化度，使酯化度小于20％后再通过凝胶层析或分子量截流，获得分子量5～15kDa的苹果多糖。
2、 如权利要求1所述的苹果多糖，其特征在于所述步骤(1)中，是取 榨汁的苹果渣，经水煮醇沉，反复冻融除蛋白，活性炭脱色，获得苹果粗多糖; 所述步骤(2)中，将粗多糖采用甲醇皂化(1N NaOH， 24小时)，或者通过硼 氢化钠还原后；再通过碱(PH=9-10)与酸(pH=3-5)水解后，或者经过果胶酶(pH=4-5)水解，使酯化度小于20%后，再通过凝胶柱层析或分子量截流，获 得目标苹果多糖。
3、 如权利要求1所述的苹果多糖的制备方法，依次包括下述步骤(l)获 得苹果粗多糖；(2)降低酯化度，使酯化度小于20%;再通过凝胶层析或分子 量截流进行透析，获得分子量5 15kDa的苹果多糖。
4、 如权利要求1所述的苹果多糖在制备预防及抑制肿瘤转移药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及预防及抑制肿瘤转移的药物技术领域，具体涉及一种苹果多糖、其制备方法及在预防抑制肿瘤转移药物中的应用。本发明的目的之一是提供一种作为预防和抑制肿瘤转移药物使用的改构苹果多糖(MAP)，目的之二是提供上述苹果多糖的制备方法，目的之三是提供上述苹果多糖在制备预防和抑制肿瘤转移药物中的应用，以填补抗肿瘤转移药物的严重短缺。本发明提供的技术方案一种苹果多糖，由下述的方法制备而成，包括下述步骤(1)获得苹果粗多糖；(2)降低酯化度，使酯化度小于20％后再通过凝胶层析或分子量截流，获得分子量5～15kDa的苹果多糖。
文档编号A61K36/185GK101167831SQ20071001895
公开日2008年4月30日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者莉 刘, 阳 孙, 李宇华, 梅其炳, 卉 白 申请人:刘 莉;梅其炳