桑黄菌丝体多糖、制备方法及其在抗肿瘤的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然产物开发领域，涉及桑黄菌丝体多糖在抗肿瘤药物中的应用，具 体是桑黄菌丝体多糖的制备及结构和其可抑制肿瘤细胞的生长。
【背景技术】
[0002] 桑黄（Phellinus igniarius)作为珍稀的药用真菌，多糖为其主要活性成分，且由 于其良好的抗肿瘤、抗氧化和增强机体免疫功能的作用而得到大量的关注。
[0003] 由于桑黄子实体特殊的生长环境和外部环境条件的限制，使得自然形成的桑黄子 实体很少，同时也给人工栽培加大了难度，造成桑黄资源的开发研宄缓慢。经研宄发现，桑 黄菌丝体多糖在抗肿瘤方面和桑黄子实体具有相当的活性。因此采用液体发酵，通过摇瓶 发酵得到桑黄（P. igniarius)菌丝体，并对桑黄菌丝体粗多糖进行分离纯化，得到纯度较 高的桑黄菌丝体多糖。同时对其进行活性研宄和结构分析，使其能够更好地应用于保健品、 抗癌药物治疗的开发。
[0004] 本发明所涉及的桑黄（Phellinus igniarius)菌丝体均一多糖的结构，迄今未见 相关报道。
【发明内容】
：
[0005] 本发明提供桑黄菌丝体均一多糖的制备及结构分析，同时提供了桑黄菌丝体均一 多糖的抗肿瘤活性研宄。
[0006] 本发明所述的桑黄菌丝体均一多糖是从桑黄菌丝体中获得，其一级结构重复单元 如通式（1):
[0007]
[0008]
[0009] 其中，Glc代表葡萄糖，Rha代表鼠李糖，1，3, 4, 6代表取代基的位置。
[0010] 本发明的桑黄菌丝体均一多糖的制备方法，按照下述步骤进行：
[0011] 1)桑黄Phellinus igniarius菌种，菌株编号为5. 95,购于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，桑黄菌丝体摇瓶发酵显示：在接种量10%，温度 28°C，转速135r/min，培养8天，得到桑黄菌丝体干重为4. 53g/L。
[0012] 2)桑黄菌丝体经热水提取，乙醇分级沉淀得到桑黄菌丝粗多糖IPS30、IPS60和 IPS80〇
[0013] 3)桑黄菌丝体粗多糖经DESE-52纤维素离子交换柱分离和S印hacryl S-400 凝胶柱纯化后得到桑黄菌丝体均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4,且经 HPSEC-RI-MALLS 检测分子量分别为 34. lkDa、17. 7kDa、15. IkDa 和 21. 7kDa。
[0014] 4)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的红外光谱分析表明 四种均一多糖均为α型D-葡萄吡喃糖。
[0015] 5)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的气相色谱显示 IPSW-l、IPSW-2和IPSW-3都只包含葡萄糖，而IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和 半乳糖，摩尔比为 1. 29:1. 21:1. 0:43. 86:1. 86。
[0016] 6)桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4高碘酸氧化、Smith降 解、甲基化和核磁共振分析显示：IPSW-1主链为Glc (1 - 6)和Glc (1 - 3, 4)，非还原性末 端为61。；1卩51-2主链为61。（1 - 6)、61。（1 - 3,4)和61。（1 - 3,6)，端基为61(：;1?5评-3 主链为Glc (1 - 6)、Glc (1 - 3, 4)和Glc (1 - 3,6)，非还原性末端为Glc ;IPSW-4主链为 Glc(l - 6)和Glc(l - 3, 4)，支链为Rha(l - 2)，非还原性末端为Glc。
[0017] 7)MTT试验结果显示：桑黄菌丝体均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4对 体外培养肝癌细胞H印G2和肠癌细胞SW480的增殖具有显著的抑制作用。
[0018] 包含本发明化合物的药物可以作为单独的抗肿瘤药物使用，也可以与其它药物联 合使用。
[0019] 包含本发明化合物的药物可以制成各种药物剂型使用。
【附图说明】
[0020] 图1为均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 :桑黄菌丝体的发酵
[0022] 种子液培养 250mL摇瓶中装新鲜PDB培养基100mL，Phellinus igniarius NO. 5. 95 (CGMCC)菌种接活化后的平板母种5块，每块0. 25cm2。置于28°C、135r/min恒温 摇床培养振荡8天。
[0023] 上述的IL种子液培养基：200g/L马铃薯，葡萄糖20g/L，KH2P0 4lg/L、 MgSO4 · 7Η200· 5g/L。
[0024] 摇瓶发酵培养 500mL摇瓶中装新鲜发酵培养基200mL，接种量10%，培养5天。 培养条件同种子液培养，得桑黄菌丝体。
[0025] 上述的IL发酵培养基：小麦粉51. 6g/L、麸皮13. 8g/L、桑枝粉10g/L、 KH2PO4O. 98g/L、MgSO4 · 7H20 0· 54g/L。
[0026] 实施例2 ;桑黄菌丝体多糖的提取、分离和纯化
[0027] 桑黄菌丝体粗多糖的提取桑黄菌丝体用蒸馏水冲洗，冻干，粉碎，10倍体积乙醇 脱脂两次。除去乙醇后得到的烘干的固体物加10倍体积的蒸馏水沸水浴提取3次，合并上 清液，减压浓缩至1/4,加95%乙醇使乙醇最终浓度为30%，离心得到的沉淀冻干并命名为 IPS30，继续加95 %乙醇使浓度为60 %，得沉淀，命名为IPS60，重复，使乙醇浓度为80 %，沉 淀命名为IPS80。
[0028] 桑黄菌丝体多糖的分离纯化分别取桑黄粗多糖IPS30、IPS60和IPS8010g，完全 溶解于20mL蒸馏水，上于已经平衡好的DEAE-52纤维素离子交换柱，依次用蒸馏水，0. 1、 0. 2、0. 3、0. 4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动收集器收集，苯酚硫酸法和示差折光 检测器同步检测，合并相同馏分，减压浓缩，透析，冷冻干燥，获得桑黄菌丝体多糖IPS30W、 IPS60W 和 IPS80W。IPS30W、IPS60W 和 IPS80W 复溶于蒸馏水，用 S印hacryl S-400 凝胶柱 层析（1.5X100cm)对离子交换柱分离出的馏分进一步纯化。蒸馏水洗脱，自动收集器收 集，RI和苯酚硫酸法同步检测，合并相同馏分，减压浓缩，冷冻干燥，得桑黄菌丝体纯化多糖 IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3 和 IPSW-4。
[0029] 桑黄菌丝体纯化多糖的纯度鉴定和分子量测定高效液相色谱仪（HPLC)联合折 光示差检测器（RI)和多角度光散射仪DAWN HELEOS- II进行多糖的纯度鉴定和分子量测 定，色谱柱：TSK-GEL 3000PW(7. 5X300mm)，流动相：0· lmol/L 的 NaCl 溶液，流速：0· 5mL/ min，柱温：30°C。检测结果表明，IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IP