香菇多糖及其提取纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于香菇多糖的提取纯化领域，具体涉及一种能保持香菇多糖活性三螺旋 结构、产率高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法及在该方法下制备得到的香 菇多糖。
【背景技术】
[0002] 香葫多糖（Ientinan)是伞葫科真菌香葫子实体中提取得到的一种多糖，是由 β- (1，3)_糖苷键连接的主链和β- (1，6)糖苷键连接的支链组成的葡聚糖。最新研宄 表明：香菇多糖具有抗肿瘤作用，香菇多糖可通过调节人休内有免疫功能的T细胞活性， 从而产生细胞介导的抗肿瘤效果，并且对正常的细胞无毒副作用。香菇多糖还对大多数生 物体的SOD的活性有促进作用，能特异化清除人体超氧自由基[02]，对机体的保护有抗衰 老、抗炎病、抗自身免疫病、抗辐射等积极作用，所以香菇多糖是抗衰老、抗癌和提高免疫功 能的有效成份之一。由于香菇多糖的医学功效广泛且几乎没有任何副作用，因而被认为是 继手术、放疗、化疗之后的第4种生物免疫疗法。
[0003] 然而，目前对于香菇多糖的提取纯化存在如下几个难题：（1)香菇多糖的提取纯 化产率非常低；（2)采用大量有机溶剂(如氯仿、正丁醇等)，容易造成环境污染以及成本的 提高；（3)活性成分受提取纯化过程影响严重，产率的提高通常造成活性的丧失。
[0004] CN1978467A和CN101643514A虽然避免了有机溶剂的大量使用，但其产率分别仅 为2. 4g/25kg和0. 67% ;CN103724447A虽然获得了超过1%的产率(纯化率乘以提取率)，但 使用了大量氯苯和Sevage试剂，不仅生产成本高昂且环境污染性极大；CN103694366A虽然 避免了有机溶剂的大量使用，但多糖含量和产率均很低。
[0005] 包含上述研宄的现有技术采用了各种方法(如水提取、酶解提取、水提取与酶解提 取联用、醇沉、过层析柱等）对香菇多糖进行提取纯化，但均未同时解决提高产率、避免环境 污染和控制成本的三大难题。更进一步而言，现有技术在尚未解决上述难题的前提下，更无 法攻克在解决上述难题下还使得香菇多糖保持活性三螺旋结构的更重大的难题。
[0006] 鉴于上述研宄现状，本领域亟需寻找一种能保持香菇多糖活性三螺旋结构、产率 高、多糖含量高、经济环保的香菇多糖提取纯化方法。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种香菇多糖的提取纯化方法，其 特征在于，所述方法包括步骤： 1) 将香菇子实体切碎或粉碎； 2) 提取：采用碱水提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05~0. 1 %的 碱性蛋白酶，于45~60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0~7. 0,灭活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下搅拌酶解1~5小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50%-90 % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置至少2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋 酸洗涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。
[0008] 本发明的发明人经过大量实验摸索发现，采用如上提取纯化方法，在避免使用大 量有机溶剂的基础上，还可以获得非常优秀的产率，更重要的是获得的香菇多糖的活性三 螺旋结构没有丧失。
[0009] 由于在提取多糖的同时，将会产生副产物(如碱性蛋白）。本发明的发明人通过摸 索发现，在利用碱性蛋白酶的同时加一定比例的中性蛋白酶，可得很好的提取效果。
[0010] 另外，采用浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基三甲胺水溶液可以得到很好的多糖 收率。
[0011] 优选的，步骤2)中的提取方法为：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓 度为0. 5%-2% (w/v)的氢氧化钠水溶液，室温搅拌提取2-3 h，调pH至中性，过滤，得到提取 液。
[0012] 优选的，步骤3)中所述碱性蛋白酶的酶活不小于40万U/g，所述中性蛋白酶的酶 活不小于10万u/g。
[0013] 优选的，步骤5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗涤的方法为：加入3~4倍粗多糖干 样体积的浓度为20 -50 % (v/v)醋酸，搅拌1-2 min，静置20 min后，于5000 rpm下离心 10 min，得到香菇多糖中间体沉淀。
[0014] 优选的，步骤6)中所述醇沉方法为：加入乙醇，至乙醇终浓度为50%_90 % (v/v)， 进行沉淀，静置2~4小时后离心取沉淀用无水乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0015] 优选的，所述方法在步骤5)之后还包括脱色步骤：向步骤5)所得香菇多糖中间体 加入碱水复溶，上离子交换树脂收集洗脱液，得脱色液。具体为：将香菇多糖中间体用浓度 为4%~10% (w/v)氢氧化钠水溶液复溶，加入量为10~20倍香菇多糖中间体干重，得到 香菇多糖溶液；香菇多糖溶液调至pH=6~7,超滤脱去大部分盐后上样于阴离子交换树脂 柱，利用纯化水洗脱，收集洗脱液；洗脱液上样于阳离子交换树脂柱，纯化水洗脱，收集洗脱 液，得到脱色提取液。
[0016] 优选的，在脱色步骤之后还包括控制多糖分子量步骤：将所得脱色液依次经过微 滤、超滤、浓缩，得到浓缩液。具体为：脱色提取液用2微米微滤膜过滤，得初滤液；对初滤液 用20000Da的中空纤维膜进行超滤；浓缩至3~6倍香菇多糖中间体干重量体积，取出，得 到浓缩液。
[0017] 本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的香菇多糖，该香菇多糖为类 白色粉末，含量96~102%，旋光度为0~17°，红外光谱无 α构型吸收峰，具有活性三螺 旋结构，重均分子量为40~80万Da。
[0018] 本发明的有益效果： 1) 本发明避免了有机溶剂的大量使用，环保性高，生产成本低； 2) 本发明精制香菇多糖含量和产率显著优于现有技术； 3) 本发明所得香菇多糖具有活性三螺旋结构； 4) 本发明制备工艺简单、设备要求不苛刻，十分利于工业化。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所得香菇多糖的红外光谱结果； 图2为本发明所得香菇多糖的三螺旋结构分析图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 1) 将香菇子实体切碎； 2) 提取：采用1%氢氧化钠水溶液，2000转/分搅拌提取2h 提取，过滤得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 05 %的碱性蛋 白酶，于60 °C下搅拌酶解1~5小时，将酶解液的pH值调至6. 0,灭活，得到一次酶解液； 向一次酶解液加入香葫子实体重量〇. 05 %中性蛋白酶，于60 °C下搅拌酶解5小时，灭活， 得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为50% % (v/v)，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置2小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入无水乙醇至终浓度60%，4°C静置12h，5000转/分离心6分钟，得到精制香菇多 糖。
[0022] 实施例2 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取2h，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入0. 1 %的碱性蛋白酶，于45 °C下 搅拌酶解1小时，将酶解液的pH值调至7. 0,灭活，得到一次酶解液；向一次酶解液加入0. 1 %中性蛋白酶，于45 °C下搅拌酶解1小时，灭活，得到脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置3小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为50 % (v/v)醋酸洗涤， 得到香菇多糖中间体沉淀； 6)加入乙醇，至乙醇终浓度为50% (v/v)，进行沉淀，静置4小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0023] 实施例3 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的浓度为0. 5%-2% (w/v)氢氧化 钠水溶液，室温搅拌提取3h)，调pH至中性，过滤，得到提取液； 3) 脱蛋白：将步骤2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子实体重量0. 08 %的碱性蛋 白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，将酶解液的pH值调至6. 5,灭活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子实体重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下搅拌酶解3小时，灭活，得到 脱蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步骤3)所得脱蛋白的提取液加无水乙醇，至乙醇终浓度为80 % (v/v )，进行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步骤4)所得粗多糖加入重量为香菇子实体干重30倍的水，于搅拌状态下，缓慢加 入浓度为10 %(w/v)氢氧化十六烷基二甲胺水溶液，至无沉淀产生，控制加入过程中的pH 为11~12 ;于4°C下静置4小时，离心取出香菇多糖沉淀，用浓度为20-50 % (v/v)醋酸洗 涤，得到香菇多糖中间体沉淀； 6) 加入乙醇，至乙醇终浓度为90 % (v/v)，进行沉淀，静置2小时后离心取沉淀用无水 乙醇洗涤，干燥得到精制香菇多糖。
[0024] 实施例4 1) 将香菇子实体粉碎； 2) 提取：加入体积为香菇子实体干重所占体积20倍的氢氧化钠水溶液0. 5%-2% (w/ V )，室温搅拌提取（2.