专利名称：枸杞多糖分离纯化新技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
中国药典1977年以后版本明确药用枸杞是宁夏枸杞Lycium barbaum L.的干燥成熟果实。亦称枸杞子。医学界通过药理和临床试验研究，认为宁夏枸杞中的主要生物活性物质是枸杞多糖(Lycium Barbarum polysaccharida.LBP)，是一种非特异性的免疫增强剂，能提高机体免疫功能，增强抗病能力，从而达到抗衰老、抗氧化、抗肝炎、抗肿瘤以及抗艾滋病等作用。
现有技术对枸杞多糖(LBP)的分离纯化，一般选用干枸杞子作原料，采用“划分沉淀法”，即利用溶解度不同，加入乙醇调节不同浓度来划分沉淀，即“乙醇沉淀法”提取枸杞多糖(粗品)。然后，在实验室里应用高压液相色谱仪或制备型高压液相色谱仪的小规格层析柱，采用传统经典的“柱层析方法”，先用DEAE柱层析脱色去杂。流动相洗脱液选用梯度摩尔浓度的不同碱液进行洗脱，由于上述化学反应原因产生了‘盐’，再用装填吸水量小、颗粒小的Sephadex柱脱盐，如Sephadex G-25柱；此后，再用装填吸水量大、颗粒大的Sephhadex柱层析分离，如Sephadex G-100、G-300等柱。由于采用梯度摩尔浓度的碱液洗脱，在紫外监测器的紫外图谱460nm处，出现吸收峰值，即被命名为一个‘枸杞多糖’组份。这样一来每个不同的碱液或不同梯度的摩尔浓度洗脱液洗脱，都会在460nm波长处出现一个吸收峰值，即枸杞多糖或枸杞多糖组份。故此，国内各个实验室课题组分离纯化出了很多枸杞多糖或枸杞多糖组份，其分子量亦不同，六个单糖组成的排列顺序和摩尔比值亦不相同。普遍认为枸杞多糖是一个复合多糖。
发明内容
枸杞多糖分离纯化新技术。主要是突破了传统经典的“柱层析方法”。首先，原料未使用枸杞子以“乙醇沉淀法”提取分离的枸杞多糖(粗品)；而采用了使用新鲜枸杞浆果用“膜分离提取技术”、“真空冷冻干燥”等先进新技术，分离提取的枸杞多糖(粗品)作原料。
本发明的技术方案是这样的枸杞多糖(粗品)用双蒸馏水溶解→加入DEAE柱，双蒸馏水常压、恒量，洗脱。紫外检测器监控→再常压、恒量，进入串联的DEAE柱，脱色、去杂质。紫外检测器监控→洗脱液高压(≤5MPa)、恒量加入Sephadex G-100柱→双蒸馏水高压(≤5MPa)、恒量洗脱，紫外检测器监控→在紫外图谱波长553.6nm处出现吸收峰值，收取洗脱液→真空冷冻升华干燥→白色疏松絮状纤维结晶—-枸杞多糖(LBP)。
DEAE柱层析、Sephadex G-100柱层析，流动相洗脱液选择了双蒸馏水。这一点是非常重要的！是分离纯化出的LBP除去杂质。DEAE柱装填采用湿法装填，用双蒸馏水把DEAE调制成均匀的浆液，自然压力均匀装填，不要使层析时出现湍流现象。整个层析过程都在紫外检测器监控之下。(其紫外图谱见附图
一、二)3、LBP(粗品)经DEAE柱层析脱去色素、杂质后，再用Sephadex G-100柱进行分离纯化。层析柱装填的交联葡聚糖凝胶(Sephadex)，实际是一种分子筛，由于含有大量的羟基，故有亲水特性，能在水解质中溶涨成凝胶粒子。当有分子大小不同的物质溶液通过网状结构的凝胶粒时，小分子物质自由扩散于凝胶粒的孔隙中，大分子物质则被排阻于凝胶粒外。在加入洗脱液(通常为水、盐类或一定PH缓冲液)向下移动时，各种大小分子物质在两相中不断扩散与排阻，随着不同物质的分配系数(kd)不同，则最大分子的物质最先流出，最后流出的是含有最小分子量物质的洗脱液。故此，依次分段收集，可以得到各种分子量的区断。然后，用加适当的有机溶剂使多糖析出或用真空冷冻干燥方法获得多糖。
由于枸杞多糖的分子量在9900d～88000d之间，而交联葡聚糖凝胶G-100分离多糖的范围在分子量1000d～100000d之间。故此，选择Sephadex G-100是最合适的选择。
Sephadex柱装填采用湿法装填，用双蒸馏水把Sephadex调制成均匀的浆液，然后用快速的高压氮气脉冲装填。这有利于色谱分离时分离柱的基线稳定；能使装好的制备柱与装柱器分离时柱层结构不破坏。
Sephadex柱层析进样和洗脱都要使用可以恒量的高压泵，小规格柱使用柱塞泵，大规格柱使用蠕动泵。压力最高控制在5Mpa。
整个层析过程都在紫外检测器监控中，由于进行了多次重复科学试验，可以认定在紫外波长553.6nm处的吸收峰值图谱为枸杞多糖的指纹图谱。(见附图三)同时，在Sephadex柱层析的试验过程中，我们发现在紫外波长553.6nm处，枸杞多糖的吸收峰值与枸杞多糖含量的多少呈线性关系。这就为枸杞多糖含量多少的测定，探索到了一个可靠的科学检测方法即以LBP(纯品)作为标准样，使用高压液相色谱(HPLC)仪紫外检测器在553.6nm波长处的吸收峰面积，与枸杞多糖的线性关系，制定了“HPLC法”检测LBP含量新方法。(另外申报专利)4、LBP(粗品)经DEAE柱、Sephadex柱层析后，洗脱液经过真空冷冻干燥，即获得白色疏松絮状纤维结晶—枸杞多糖(LBP)。真空冷冻干燥设备必须具备条件如下复合制药医疗卫生要求，可以消毒杀菌；捕水器—-冷阱工作温度必须保持达到零下60℃以下，才能很好的保证升华干燥进行；在干燥仓中必须具备自动液压控制真空容器封口装置，在真空冷冻干燥完成后，开仓门前，将LBP很好的真空密封保存，否则LBP极易吸潮结块、变质。
5、1000kg新鲜枸杞浆果采用“膜分离—真空冷冻干燥”新技术，可以提取分离LBP(粗品)24kg左右；再采用改进的“DEAE柱、Sephadex柱层析—真空冷冻干燥”新技术，可以分离纯化出LBP 1200g。
6、新技术分离纯化出的LBP性能特征1)、感官白色疏松絮状纤维结晶体。极易吸潮，吸潮后为淡黄色，结块。2)、溶解性极易溶于水；溶于稀碱液；不溶于乙醇、丙酮、氯仿。3)、显色反应(1)、硫酸-苯酚反应，显色，呈棕黄色，分解后成单糖。(2)、硫酸-蒽酮反应，呈阳性。(3)、考马斯亮兰反应，呈阳性。(4)、斐林试剂反应，呈阴性。(5)、碘-碘化钾反应，呈阴性。4)、吸收峰值枸杞多糖水溶液，在紫外图谱波长550nm～560nm处，有最大吸收峰值。在一定的范围内，吸收峰值与枸杞多糖含量有线性关系。5)、旋光度测定枸杞多糖水溶液，加入乙醇使其浓度为10％左右，离心得沉淀；然后上清液中再加入乙醇，使其浓度为20％～25％，离心得第二次沉淀。两次沉淀物的比旋度相同，说明枸杞多糖为单一组份。6)、凝胶柱层析法鉴定在Sephadex G-100柱层析时，在紫外图谱波长553.6nm处的吸收峰，是单一的两侧对称峰形状。说明枸杞多糖的组份为单一组份。(图谱见附图三)7)、层析分离纯化的枸杞多糖，LBP含量分析总含量92.41％。(1)、六个单糖总量84.34％。(2)、微量元素含量4.48％。(3)、氨基酸含量3.59％。
权利要求
1.枸杞多糖分离纯化新技术，采用改进的‘柱层析方法’、‘真空冷冻干燥方法’从枸杞多糖(粗品)中分离出枸杞多糖(LBP)，其特征在于枸杞多糖(粗品)溶于双蒸馏水后，然后用DEAE柱进行两次脱色除去杂质；再用SephadexG-100柱进行分离纯化；然后再经过真空冷冻升华干燥，即得到白色疏松絮状纤维结晶—-枸杞多糖(LBP)纯品。
2.根据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之一在于原料‘枸杞多糖(粗品)’是用新鲜枸杞浆果制备的枸杞原汁，经过膜分离提取和真空冷冻干燥，获得小于10万分子量的枸杞多糖(粗品)。其主要特点是LBP含量高；而传统工艺‘乙醇沉淀法’从枸杞子中分离提取的枸杞多糖(粗品)，在枸杞干制以及乙醇沉淀中多次受化学制剂的作用，对枸杞多糖结构中的糖链多少有影响，并且获得的枸杞多糖中LBP含量很低，杂质偏高，不是分离提取LBP的最合适原料。
3.根据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之二在于首先，使用改进的DEAE柱进行层析。使用二乙基氨基乙基(DEAE)(OH-型)纤维素柱，串联两个柱更好地脱色除去杂质。通过科学试验，我们已将制备型3、DEAE柱规格，从φ16mm×h 200mm逐步扩大到φ300mm×h 1000mm的大柱，对枸杞多糖(粗品)进行柱层析脱色除去杂质，可以达到工业化制备的规模；DEAE柱装填采用湿法装填。
4.跟据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之三在于在使用DEAE柱层析后，再用Sephadex交联葡萄糖凝胶G-100进行分离纯化。经过科学实验，我们已经将Sephadex柱规格扩大，从φ16mm×h 200mm，逐步扩大到φ100mm×h 1000mm高压玻璃柱层析，再扩大即使用不锈钢层析柱；作为流动相的洗脱液，选择了双蒸馏水溶液；Sephadex柱装填采用湿法装填，先将Sephadex G-100用双蒸馏水调制成均匀的浆液，再用高压氮气脉冲装填。在进料和洗脱时，小规格柱用高压柱塞泵恒量进样，大规格柱用蠕动泵恒量进样。压力要求控制在最高5Mpa。
5.根据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之四在于DEAE柱和Sephadex层析时，使用制备型高压液相色谱仪的紫外检测器进行监控，在553.6nm波长处谱线出现吸收峰值。经多次重复试验，可以认定SephadexG-100柱层析紫外检测器553.6nm波长处的吸收峰值谱线图是枸杞多糖(LBP)的指纹图谱。
6.根据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之五在于经DEAE柱和Sephadex柱层析后，再将洗脱液真空冷冻升华干燥，制备得—-白色疏松絮状纤维结晶枸杞多糖(LBP)纯品。要求，真空冷冻干燥设备的捕水器—-冷阱，温度必须在零下60℃以下才能保证其升华干燥；真空冷冻干燥设备必须具备可以消毒杀菌条件，并且在干燥仓内有液压自动控制真空封口设备，以保证制备的LBP附合医药卫生规定，并且可以在真空状态下保存不变质。
7.根据权利要求1所述，枸杞多糖分离纯化新技术，其特征之六在于DEAE和Sephadex柱层析，洗脱液选择了双蒸馏水。传统工艺一般来说都是使用‘梯度摩尔浓度碱液’进行洗脱，由于碱液的作用，首先就产生了‘盐’，就要用另外的设备如Sephadex G-25柱进行脱盐；其二就是使易在碱性、酸性、酶作用下水解的多糖由于碱性作用而水解。即出现了每一个摩尔浓度的碱液洗脱，在紫外监测器460nm处层析分离出一个“枸杞多糖组份”，使枸杞多糖人为的变成复合多糖。而我们使用双蒸馏水洗脱，不会产生水解作用，组成枸杞多糖的六个单糖的糖链不会被打断，在紫外图谱波长553.6nm处只出现一个吸收峰值，这个峰是一个以轴线对称的峰；分离出的LBP水溶液加入乙醇使其浓度为10％，离心得沉淀，然后上清液再加入乙醇使其浓度为20％～25％，离心得沉淀物，两次沉淀物的比旋度亦相同。证明了分离出的枸杞多糖是单一组份的枸杞多糖(LBP)，纯度在92％以上。经检测分析六个单糖总量84.34％，氨基酸含量3.59％，微量元素含量4.48％。总计92.41％。由于可以认定LBP是单一组份，纯度在90％以上，就具备了我们国家规定申报中药第一类新药的基本条件。
全文摘要
枸杞多糖分离纯化新技术属生物工程制药领域。采用新鲜枸杞浆果分离提取的枸杞多糖(粗品)作原料，首先用DEAE两个柱串联层析，进行脱色、除去杂质；再用SephadexG－100柱层析，进样和洗脱使用恒量、高压(≤5MPa)泵。在柱层析时，洗脱液都使用的是双蒸馏水，制备柱已经扩大到工业中试规模。层析过程使用了紫外检测器进行监控，在紫外图谱波长550mm～560mm处出现吸收峰。洗脱液经真空冷冻升华干燥，获得白色疏松絮状纤维结晶——枸杞多糖(LBP)。新技术分离纯化的枸杞多糖，LBP含量在92％以上，是单一组份，在SephadexG－100柱紫外波长553.6nm吸收峰值图谱为LBP的指纹图谱。
文档编号C08B37/00GK1448408SQ0210891
公开日2003年10月15日 申请日期2002年4月3日 优先权日2002年4月3日
发明者敖尔戈勒 申请人:敖尔戈勒