专利名称：药用植物多糖的纯化方法
药用植物多糖的纯化方法技术领域 本发明涉及一种多糖的纯化方法，特别是药用植物多糖 的纯化方法。
背景技术：
多糖又称多聚糖，是由单糖縮合成的多聚物，它是生物 体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。研究表明多糖具有多 种生物功能，如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等，因此 对多糖的研究愈来愈引起国内外生物学家、化学家和药理学家的兴趣，有 关专家预言"21世纪将是多糖的时代"。目前，多糖的研究范围涉及提取、分离、纯化、相对分子质量确定、 结构分析、构效关系等多个方面。多糖的纯化是对多糖进行研究和分析的 基础，文献报道中多糖的纯化大部分只涉及到脂类物质的脱除、蛋白的脱 除、色素的脱除以及其他一些小分子物质的分离，而对核酸的脱除并未涉及到。另外，文献报道中的杂蛋白的脱除方法为Sevage法、三氟三氯乙垸 法或三氯醋酸法，以Sevage法最多。用以上方法脱除蛋白质往往存在着蛋 白质脱除不彻底的现象。本发明的药用植物多糖的纯化方法是在提取出粗 多糖的基础上进行的，在以往的纯化方法中添加了除核酸这一步骤，同时 改进了杂蛋白的脱除方法，采用冷酚抽提法，使得蛋白质的脱除率大大提 高，纯化后的多糖纯度进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种药用植物多糖新的纯化方法。 本发明的药用植物多糖的纯化方法包括提取粗多糖、去除核酸、去除 脂类、脱除蛋白和柱层析分离，具体方法包括以下步骤1、 提取粗多糖取药用植物中多糖含量高的组织，如芦荟叶、人参的块茎、枸杞的果实……，粉碎后加5 20倍(重量)的水，常温浸提不 少于72h; 5000rpm离心后取上清液浓縮1~5倍，添加乙醇使乙醇的终浓 度为55%~85%，然后8000rpm离心分离沉淀，烘干后得粗多糖；2、 去除核酸取粗多糖，用蒸馏水溶解，使其浓度为l~10g/L;添 加CaCl2调整离子强度，使Ca"农度为0.1 2mol/L;然后用乙醇沉淀核酸，乙醇终浓度为10% 40% (v/v)， 4 9。C静置时间不少于4h，然后以 5000 10000rpm的转速离心脱除核酸沉淀，回收上清液；3、去除脂类向脱除核酸后的离心上清液中添加乙醇使乙醇的终浓 度为55% 85% (v/v)， 4 9。C静置，时间不少于12h，以5000~10000rpm 的转速离心，回收的沉淀为去核酸多糖；将去核酸的多糖分别用乙醇、丙 酮和乙醚洗涤2 3次，以洗掉脂质，并于室温下挥发去掉乙醚，得脱脂粗 多糖；4、脱除蛋白采用冷酚抽提法脱除蛋白，将脱脂粗多糖用0.1 1 mol/L 的醋酸钠溶液溶解，使脱脂粗多糖的浓度为5 10mg/L;然后添加2 3倍 (v/V)的冷酚溶液抽提蛋白，震荡不少于30min;震荡完毕后用 8000 12000rpm的转速离心，回收上清液；最好将此回收的上清液按上述 方法连续抽提蛋白3次；然后移入透析袋中用双蒸水透析不少于72h，透 析温度为4~9°C;然后向透析液中添加乙醇沉淀多糖，使乙醇终浓度为 55% 85% (v/v)， 4 9。C静置不少于12h;再以5000 10000rpm的转速离 心分离多糖沉淀；将多糖沉淀分别用乙醇、丙酮和乙醚洗2 3次后，在室 温下挥发掉乙醚，即得精多糖；5、柱层析分离采用柱层析梯度分离，收集精多糖的单峰洗脱液； 先用截留分子量为5KD 10KD的膜包浓縮10倍，然后再次醇沉，离心收 集多糖沉淀；多糖沉淀经真空冷冻干燥即得纯多糖；所采用的检测器为紫 外检测器；柱子装料和检测波长可根据植物多糖实际情况进行选择。本发明所采用的试剂均为分析纯。由于本发明在纯化多糖的方法中增加了除核酸，并采用冷酚抽提法脱 除蛋白质，使得杂蛋白的脱除率达90%以上，制得的多糖纯度高，为多糖 在相对分子质量确定、结构分析、构效关系等方面的研究奠定了基础。
具体实施方式
为了充分公开本发明植物多糖的纯化方法，以下结 合实施例加以说明，但本发明并不局限于此实施例。
实施例l:人参多糖的纯化方法，包括以下步骤
1、取人参茎粉碎后加IO倍的水，常温浸提72h。以5000rpm的转速 离心去掉残渣。取上清液浓縮2倍，添加无水乙醇使其终浓度为65%，然后以8000rpm的转速离心分离沉淀，沉淀烘干后得人参粗多糖；2、 取人参粗多糖10g用蒸馏水溶解，浓度为10g/L。添加CaCl2调整 离子强度，使C^+浓度为0.5mol/L。然后用无水乙醇沉淀核酸，乙醇终浓 度为30%， 4 9。C静置4h，以10000rpm的转速离心脱除核酸沉淀，回收 上清液；3、 向脱除核酸后的离心上清液中继续添加无水乙醇使其终浓度为 65%， 4 9'C静置12h。静置完毕后以10000rpm的转速离心分离多糖沉淀。 所得的脱除核酸的多糖用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉 脂质，并于室温下挥发掉乙醚，得脱脂粗多糖；4、 用0.2mol/L的醋酸钠溶液溶解脱脂粗多糖，使其浓度为10mg/L。 接着添加3倍的冷酚溶液，震荡30min以抽提蛋白。震荡完毕后以8000rpm 的转速离心，回收上清液。将此回收的上清液抽提蛋白2次，然后移入透 析袋中用双蒸水透析72h，透析温度为4 9。C。透析好的上清液用无水乙 醇沉淀，乙醇终浓度为65%， 4 9。C静置12h，再以10000rpm的转速离心 得多糖沉淀。此多糖沉淀用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3次，室温 下挥发掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出现沉淀，则采用0.1mol/L 的NaCl溶液进行透析；5、 为进一步纯化，采用DEAE-Toyoparl及ConA-Sepharose层析柱， 紫外检测器，波长为385nm。回收精多糖主峰洗脱液，先用截留分子量为 8KD的膜包浓縮10倍，然后再次醇沉，终浓度为65%，离心收集沉淀， 经真空冷冻干燥即得人参纯多糖。实施例2:枸杞多糖的纯化方法，包括以下步骤1、 取枸杞果实破碎后加6倍的水，常温浸提72h，以5000rpm的转 速离心去掉残渣。取上清液浓縮2倍，添加无水乙醇使其终浓度为75%， 然后以8000rpm离心分离沉淀，沉淀烘干后得枸杞粗多糖；2、 取枸杞粗多糖10g用蒸馏水溶解，浓度为5g/L。添加CaCb调整 离子强度，使(^2+浓度为lmol/L。用无水乙醇沉淀核酸，乙醇终浓度为 30%， 4 9。C静置4h后以10000rpm的转速离心脱除核酸沉淀，回收上清 液；3、向脱除核酸后的离心上清液中继续添加无水乙醇使其终浓度为75%, 4 9。C静置12h。静置完毕以10000rpm的转速离心多糖沉淀。所得 的脱除核酸的多糖用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉脂质， 并于室温下挥发掉乙醚，得脱脂粗多糖；4、用0.3 mol/L的醋酸钠溶液溶解脱脂粗多糖，使其浓度为5mg/L。 接着添加3倍的冷酚溶液，震荡30min以抽提蛋白。震荡完毕后以8000rpm 的转速离心，回收上清液。将此回收的上清液抽提蛋白3次，然后移入透 析袋中用双蒸水透析72h，透析温度为4 9'C。透析好的透析上清液用无 水乙醇沉淀，使乙醇终浓度为75%， 4 9。C静置12h，以10000rpm的转速 离心得多糖沉淀。此多糖沉淀用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3次， 于室温下挥发掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出现沉淀，则采用 O.lmol/L的NaCl溶液进行透析；5、为进一步纯化，采用sephadexG-200层析柱，紫外检测器，波长 为360nm。回收精多糖主峰洗脱液，先用截留分子量为3KD的膜包浓縮 10倍，然后再次醇沉，终浓度为75%，收集沉淀，经真空冷冻干燥即得 枸杞纯多糖。实施例3:黄芪多糖的纯化方法，包括以下步骤1、 取黄芪根粉碎后加IO倍的水，常温浸提72h，以5000rpm离心后 去掉残渣。取上清浓縮3倍，添加无水乙醇使其终浓度为80%，然后以 8000rpm离心分离沉淀，沉淀烘干后得黄芪粗多糖；2、 取黄芪粗多糖10g用蒸馏水溶解，浓度为8g/L。添加CaCl2调整 离子强度，使Ca^浓度为1.5mol/L。用乙醇沉淀核酸，乙醇终浓度为35%， 4 9。C静置4h后以10000rpm的转速离心脱除核酸沉淀，回收上清液；3、 向脱除核酸后的离心上清液中继续添加乙醇使其终浓度为80%, 4 9"静置12h，以10000rpm的转速离心分离多糖沉淀，所得的脱除核酸 的粗多糖用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3次，以洗掉脂质，并于室 温下挥发掉乙醚，得脱脂粗多糖；4、用0.5mol/L的醋酸钠溶液溶解脱脂粗多糖，使其浓度为8mg/L。 接着添加3倍的冷酚溶液，震荡30min以抽提蛋白。震荡完毕后以8000rpm的转速离心，回收上清液。将此回收的上清液抽提蛋白3次，然后移入透析袋中用双蒸水透析72h，透析温度为4 9。C。将透析好的透析上清液用 无水乙醇沉淀，使乙醇终浓度为80%， 4 9。C静置12h，以10000rpm的转 速离心得多糖沉淀。此多糖沉淀用无水乙醇、无水丙酮和乙醚逐次洗3 次，于室温下挥发掉乙醚即得精多糖。如果透析上清液出现沉淀，则采用 0.1mol/L的NaCl溶液进行透析；5、为进一步纯化，采用Sepharose CL-4B层析柱，紫外检测器，波 长为230nm。回收精多糖主峰洗脱液，先用截留分子量为8KD的膜包浓 縮10倍，然后再次醇沉，终浓度为80%，收集沉淀，经真空冷冻干燥即 得黄芪纯多糖。
权利要求
1、一种药用植物多糖的纯化方法，包括提取粗多糖、去除核酸、去除脂类、脱除蛋白和柱层析分离，其特征在于(1)所述的去除核酸的方法，即取药用植物的粗多糖，用蒸馏水溶解，使其浓度为1～10g/L；添加CaCl2调整离子强度，使Ca2+浓度为0.1～2mol/L；然后用乙醇沉淀核酸，乙醇终浓度为10％～40％，4～9℃静置时间不少于4h，然后以5000～10000rpm的转速离心脱除核酸沉淀，回收上清液；(2)所述的脱除蛋白的方法，即采用冷酚抽提法脱除蛋白，将脱脂粗多糖用0.1～1 mol/L的醋酸钠溶液溶解，使脱脂粗多糖的浓度为5～10mg/L；然后添加2～3倍的冷酚溶液抽提蛋白，震荡不少于30min；震荡完毕后用8000～12000rpm的转速离心，回收上清液；然后移入透析袋中用双蒸水透析不少于72h，透析温度为4～9℃；然后向透析液中添加乙醇沉淀多糖，使乙醇终浓度为55％～85％，4～9℃静置不少于12h；再以5000～10000rpm的转速离心分离多糖沉淀；将多糖沉淀分别用乙醇、丙酮和乙醚洗2～3次后，在室温下挥发掉乙醚。
2、 根据权利要求1所述的一种药用植物多糖的纯化方法，其特征在 于所述脱除蛋白的过程中，连续抽提蛋白2~5次，然后移入透析袋中透析。
3、 根据权利要求1或2的方法纯化的药用植物多糖。
全文摘要
一种药用植物多糖的纯化方法，包括提取粗多糖、去除核酸、去除脂类、脱除蛋白和柱层析分离。本发明在纯化多糖的过程中增加了除核酸，并采用冷酚抽提法脱除蛋白质，使得杂蛋白的脱除率达90％以上，制得的多糖纯度高，为多糖在相对分子质量确定、结构分析、构效关系等方面的研究奠定了基础。
文档编号C08B37/00GK101215336SQ200810070499
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者宋洪波, 王金亮 申请人:福建农林大学