一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方 法、应用。
【背景技术】
[0002] 黑莓沿//ws spp. Blackberry为蔷薇科悬钩子属聚合果类植物，未作药用，是世界 上新兴的4种小果类果树之一，原产北美，其果实酸甜可口，具有很高的营养价值和药用价 值，除鲜食外还大部分制成速冻果、果汁、果酒和果酱等食品。文献检索发现对黑莓研究主 要集中在果实挥发油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓叶、种子中黄酮、花色苷及维生素E含量 分析方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有约27. 14%的功能性油脂， 其中不饱和脂肪酸总量高达93. 55%，此外还有人体必需的氨基酸，在对抗动脉粥样硬化、抗 糖尿病、免疫调节、促进生长和智力发育等方面具有重要的作用。
[0004] 凝血的实质是呈水溶性的纤维蛋白原转变为水中不溶解的固态纤维蛋白的过程， 是在内源性或(和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血 酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途 径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、 XII等内源性凝血因子活性有关；TT值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要 指标；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。
[0005] 血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它 严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附、内源性和外源性凝血系统以及 纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓 疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑 块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦 堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊 状态下，需要辅助使用抗凝血药物，才能达到更好的抗血栓效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种从黑莓籽中提取的抗凝血黑莓籽多糖，同时提供该多 糖的提取分离方法、应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 抗凝血黑莓籽多糖的提取分离方法，包括以下步骤：（1)将黑莓籽粉碎，室温下用石油 醚脱脂3次，挥干溶剂石油醚后，药渣用70 %乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后向残渣中 按料液质量体积比为20 mL/g的比例加入蒸馏水提取（80 °C下提取3次，一次3 h)，趁热 抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入95%乙醇调至乙醇的终浓度为70 %，4 °C静 置24 h后离心（10000 r/min，10 min)，得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48 h，每4 h换一次 蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖； (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52 纤维素柱色谱（2. 5*60 cm)，依次用蒸馏水、0. lmol/L氯化钠溶液和0. 2 mol/L氯化钠溶液 进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐 标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（图2)，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻 干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分l，〇. 1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2,0. 2 mol/L氯 化钠溶液的洗脱峰为组分3 ; (3) 称取70 mg的组分1溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝 胶柱色谱（1.5*100cm)，用蒸馏水进行洗脱(洗脱流速为0. 5 mL/min，每管2 mL)，采用苯 酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线（图3)，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名 为BSP-2 ;组分2和3均采用组分1的方法进行洗脱，得单一洗脱峰，分别命名为BSP-3和 BSP-4 ； BSP-2、BSP-3和BSP-4即为抗凝血黑莓籽多糖。
[0008] 其中DEAE-52纤维素柱色谱为：二乙氨基乙基型纤维素，是一种阴离子交换纤维 素，常用于多糖纯化和分离。粗多糖溶液吸附于DEAE-52后，以不同离子强度的盐进行洗 脱，根据多糖的离子交换能力差异进行分离。
[0009] 其中SephadexG-100凝胶柱色谱为：是一种半合成的凝胶，基本骨架是以葡萄糖 (右旋糖酐）为残基的多糖，在链状结构间，以3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，以醚桥相互 连接成为三维空间的网状高分子化合物。
[0010] 利用上述提取分离方法得到的抗凝血黑莓籽多糖。
[0011] 抗凝血黑莓籽多糖在制备抗凝血药物方面的应用。
[0012] 本发明采用特殊的提取分离方法从黑莓籽中分离得到多糖BSP-2、BSP-3和 BSP-4,并对这三个多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明，这三个多糖均有良好的抗凝 血效果，且BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比阳性对照灯盏花素好（K0. 001)，BSP-3的抗凝 血效果与阳性对照灯盏花素相当（乃〇. 05)，可见，它们可以单独或组合用于制备抗凝血剂。
【附图说明】
[0013] 图1为凝血机制图； 图2黑莓籽粗多糖DEAE-52洗脱曲线； 图3组分1的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线； 图4组分2的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线； 图5组分3的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线； 图6标准单糖混合物的GC色谱图； 图7 BSP-2水解物GC色谱图； 图8 BSP-3水解物GC色谱图； 图9 BSP-4水解物GC色谱图；
【具体实施方式】 以下通过【具体实施方式】，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。
[0014] 黑莓籽购于河南省封丘县黑莓种植基地，为蔷薇科悬钩子属植物黑莓沿//W61 spp. Blackberry 轩。
[0015] 本文中的乙醇浓度均为体积浓度。
[0016] 1、抗凝血黑莓籽多糖的提取分离方法，包括以下步骤：（1)将黑莓籽粉碎，室温下 用石油醚脱脂3次，挥干溶剂石油醚后，药渣用70 %乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后向 残渣中按料液质量体积比为20 mL/g的比例加入蒸馏水提取，80 °C下提取3次，一次3 h， 趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入95%乙醇调至乙醇的终浓度为70 %，4 °C静置24 h后离心（10000 r/min，10 min)，得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48 h，每4 h换 一次蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖； (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52 纤维素柱色谱（2. 5*60 cm)，依次用蒸馏水、0. lmol/L氯化钠溶液和0. 2 mol/L氯化钠溶液 进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐 标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（图2)，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻 干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分l，〇. 1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2,0. 2 mol/L氯 化钠溶液的洗脱峰为组分3 ; (3) 称取70 mg的组分1溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝 胶柱色谱（1.5*100cm)，用蒸馏水进行洗脱(洗脱流速为0. 5 mL/min，每管2 mL)，采用苯 酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线（图3)，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的构成命名为 BSP-2 ;组分2和3均采用组分1的方法进行洗脱，得单一洗脱峰（图4和5)，分别命名为 BSP-3和BSP-4 ;BSP-2、BSP-3和BSP-4即为抗凝血黑莓籽多糖。
[0017] 2抗凝血黑莓籽多糖（BSP-2、BSP-3、BSP-4)的分子量测定和组分分析： 2. 1、多糖样品BSP-2、BSP-3和BSP-4送至北京市理化分析测试中心检测，根据中华人 民共和国药典（2010年版）二部附录￥11(分子排阻色谱法）进行测定。85?-2、85?-3、85?-