A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种粗多糖的制备工艺，具体涉及的是A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺。
【背景技术】
[0002]流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%?60%。当今世界各大洲发病率在1/10万?10/10万，总病死率在5%?15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。
[0003]我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A群和C群为主。
[0004]目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。研究表明，A群C群脑膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围对适龄儿童普及接种。目前纳入国家免疫计划的流脑多糖疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖疫苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0005]目前，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产工艺均是从脑膜炎球菌荚膜中提取出粗多糖，粗多糖经过纯化后获得精糖，精糖经过活化和衍生制成多糖-ADH衍生物，进而有效制成A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0006]现有技术从脑膜炎球菌荚膜中提取出粗多糖的生产过程中，粗多糖提取效率不高导致成本增加。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于解决现有技术中荚膜中提取出粗多糖的效率不高导致成本增加的问题，提供一种解决上述问题的A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺。
[0008]为解决上述缺点，本发明的技术方案如下:
A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，包括以下步骤:
(1)将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；
(2)在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；
(3)将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h，离心收集上清液；
(4)在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到20?25%，在2?8°C静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75?78%，充分振摇，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；
(5)用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。
[0009]进一步，所述步骤(2)中CTAB的终浓度为1.0g/L。
[0010]更进一步地，所述步骤(3)中搅拌时间为3h，氯化钙溶液浓度为0.5mol/L0
[0011]优选地，所述步骤(4)中第一次加入乙醇的体积终浓度为25%，第二次加入乙醇的体积终浓度为75%。
[0012]优选地，所述步骤(5 )中的干燥采用冷冻干燥方法。
[0013]本发明中，CTAB即为十六烷基三甲基溴化铵。
[0014]本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果:
本发明的方法优化了各化学物质加入反应时的比例和浓度，有效提高了荚膜中提取出粗多糖的效率，进而有效减少成本投入。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0016]实施例1
A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，包括以下步骤:
(1)将IL脑膜炎球菌的培养液利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；
(2)在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；
(3)将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h使多糖和CTAB解离，氯化钙溶液浓度为0.5mol/L，离心收集上清液；
(4)在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到25%，在2?8°C静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75%，充分振摇使多糖沉淀，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；
(5)用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖；检测出本实施例提取出的粗制多糖的质量为146mg。
[0017]实施例2
本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓度不同，具体设置如下:
步骤(2)中CTAB的终浓度为1.0g/L，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；步骤
(4)中第一次加入乙醇的体积终浓度为20%，第二次加入乙醇的体积终浓度为78% ;检测出本实施例提取出的粗制多糖的质量为152mg。
[0018]实施例3
本实施例与实施例1的区别仅仅在于，本实施例中各化学物质加入反应时的比例和浓度不同，具体设置如下: 步骤(2)中CTAB的终浓度为1.5g/L ;步骤(3)中氯化钙溶液的浓度为lmol/L ;步骤(4)中第一次加入乙醇的体积终浓度为25%，第二次加入乙醇的体积终浓度为80%，检测出本实施例提取出的粗制多糖的质量为115mg。
[0019]上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤: (1)将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液； (2)在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖； (3)将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h，离心收集上清液； (4)在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到20?25%，在2?8°C静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75?78%，充分振摇，然后静置18小时以上，离心收集沉淀； (5)用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。2.根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，其特征在于，所述步骤(2)中CTAB的终浓度为1.0g/L。3.根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，其特征在于，所述步骤(3)中搅拌时间为3h，氯化钙溶液浓度为0.5mol/L04.根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，其特征在于，所述步骤(4)中第一次加入乙醇的体积终浓度为25%，第二次加入乙醇的体积终浓度为75%。5.根据权利要求1所述的A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺，其特征在于，所述步骤(5)中的干燥采用冷冻干燥方法。
【专利摘要】本发明公开的是A群脑膜炎球菌细菌荚膜粗多糖的制备工艺。本发明包括以下步骤：（1）将培养出的脑膜炎球菌利用甲醛杀菌，将已杀菌的培养液离心收集上清液；（2）在上清液中加入CTAB至CTAB的终浓度为1.0g/L时为止，然后充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖；（3）将沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3h，离心收集上清液；（4）在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到20～25%，在2～8℃静置过夜，离心收集上清液；再在上清液中加入乙醇直至乙醇的体积终浓度达到75～80%，充分振摇，然后静置18小时以上，离心收集沉淀；（5）用无水乙醇和丙酮各洗三次后干燥，干燥后即为粗制多糖。本发明具有提取效率高等优点。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN105037579
【申请号】CN201510543283
【发明人】朱冲, 米强, 陈道远
【申请人】成都欧林生物科技股份有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月31日