专利名称：麦冬多糖mdg－1及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药活性成分及提取分离方法，具体涉及具有抗心肌缺血作用的麦冬多糖MDG-1及其分离方法和应用。
但目前对麦冬多糖仅停留在有效部位的提取，尚未有分离到均一分子量的活性多糖。
本发明公开的经分离纯化获得的麦冬多糖MDG-1是分子量为5000的β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端与α-D-Glc相连。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述麦冬多糖MDG-1的提取分离方法。
本发明公开的麦冬多糖MDG-1的提取分离方法包括下列步骤1.麦冬多糖的提取取干燥麦冬块根，压扁用5-6倍量70％-95％乙醇回流3次，弃之，药渣水提2-3次，水提液减压浓缩至0.5-1g/ml，加入75％-95％乙醇至含醇量达60％-80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬多糖粉末，得率20％左右；2.麦冬多糖的超滤分离麦冬总多糖，用水稀释15倍，10000分子量膜超滤，压力为3.5大气压，超滤液70℃浓缩后，冷冻干燥。
3.麦冬多糖的纯化取麦冬多糖2g，少量水溶解，上DEAE SepharoseFF柱，水、0.1-4mol Nacl梯度洗脱，蒽酮-硫酸法在线检测，收集水洗部分峰位，冷冻干燥后，水溶解上SephadexG50柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，再上SephadexG25柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，得到白色粉末，即为麦冬多糖MDG-1。
对用本发明提取方法获得的麦冬多糖MDG-1采用高效液相法进行纯度鉴定色谱条件SHODEX KS802色谱柱，流动相为水，流速1ml/min，柱温80℃，检测器为ELSD。多糖用适量水溶解，进样，呈单一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖。见图1。
对用本发明提取方法获得的麦冬多糖MDG-1进行结构测定MDG-1经纯度鉴别，证明已是单一组成，可以进行结构分析。
MDG-1经全水解，样品只含一种单糖，即果糖。IR中933-1及820-1两个果聚糖特有的吸收峰，也证明该多糖为一果聚糖。从13CMNR中103-104ppm异头碳信号证明该多糖为β构型，从甲基化分析中可得知该多糖是2→1及2→6连接的果聚糖，这种呋喃型的连接方式有13C及1HNMR及过碘酸盐氧化反应及Smith降解中得到进一步证实。
上述分析证明MDG-1为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)。该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述麦冬多糖MDG-1在制备治疗抗心肌缺血药物中的应用。
本发明MDG-1多糖可作为活性成分与药用辅料制得抗心肌缺血的药物，其剂型可包括各类医学上可接受的药物剂型。
用含本发明方法制得的MDG-1多糖62％的注射剂进行有关药效学研究实验通过应用心电图ST段位移值作为指标，观察麦冬多糖注射液对垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛的作用；通过应用心功能(LVSP、LVDP、LVEDP、±LVdp/dt)，血压和心率参数(SAP、DAP、MAP、HR)，血清酶肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和氧自由基如超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，心脏NBT染色所测定心肌梗死面积，HE染色的心脏形态学等作为指标，观察麦冬多糖注射液对冠状动脉结扎所致大鼠急性心肌缺血(梗塞)的作用。
1材料与方法1.1垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛实验健康、雄性的SD种大鼠78只(体重243±19g)预先给药，给药分为以下各组空白对照组腹腔注射生理盐水8ml/kg，15min后麻醉，检测心电图。
阳性对照组腹腔注射硝酸甘油(广州明兴制药厂，批号000601)10mg/kg，15min后麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(po)大剂量组预先灌胃麦冬多糖注射液3天，1g/kg，每天1次，末次给药后1h麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(po)中剂量组预先灌胃麦冬多糖注射液3天，0.3g/kg，每天1次，末次给药后1h麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(po)小剂量组预先灌胃麦冬多糖注射液3天，0.1g/kg，每天1次，末次给药后1h麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(iv)大剂量组尾静脉注射麦冬多糖注射液50mg/kg，给药后10min麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(iv)中剂量组尾静脉注射麦冬多糖注射液15mg/kg，给药后10min麻醉，检测心电图。
麦冬多糖注射液(iv)小剂量组尾静脉注射麦冬多糖注射液5mg/kg，给药后10min麻醉，检测心电图。
动物腹腔注射25％乌拉坦(上海曹杨第二化工厂，批号1998422)1.6g/kg麻醉，接肢体二导联，稳定15mim，应用Power/Lab4S型生物信号处理和分析系统记录大鼠心电图，选心电图无异常者舌下静脉注射垂体后叶素(上海生化制药厂，批号000627)0.5u/kg，记录注射垂体后叶素后5sec、15sec、30sec、1min、2min、5min、10min时的心电图变化，计算0sec～30sec、30sec～10min时间段的ST段位移值。
1.2冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血(梗塞)实验1)大鼠冠状动脉结扎术健康、雄性的Wistar种大鼠180只(体重241±20g)，腹腔注射氯胺酮(上海中西药业股份有限公司，批号010701)80mg/kg麻醉，仰卧位固定，接肢体二导联，通过Power/Lab4S型生物信号处理和分析系统监测心电图，由口腔插入气管插管，接通动物人工呼吸机(DH-140B型，浙江医科大学医学仪器实验厂)做正压呼吸(潮气量10ml/kg，呼吸时比1∶1，呼吸频率60次/分)。常规消毒，折断第3肋骨，用开胸器撑开胸腔，暴露心脏，剪开心包膜，暴露心脏，迅速将心脏挤出，用5/0号无创伤性丝线，于肺动脉圆锥和左心耳之间，距主动脉根部约2mm处结扎冠状动脉左前降支(假手术组只穿线，不结扎)，抽出胸腔内空气，迅速缝合闭胸，恢复自主呼吸后关闭动物呼吸机。心电图ST段显著抬高表示造模成功。
2)实验分组健康、雄性的Wistar种大鼠随机分成以下各组假手术(sham)组预先灌胃生理盐水3天，8ml/kg，每天1次。
缺血(AMI)组预先灌胃生理盐水3天，8ml/kg，每天1次。
普奈洛尔(Pro)组预先灌胃普奈洛尔(Propranolol，上海辛帕斯制药有限公司，批号010221)3天，15mg/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(po)大剂量组预先灌胃3天麦冬多糖注射液，1g/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(po)中剂量组预先灌胃3天麦冬多糖注射液，0.3mg/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(po)小剂量组预先灌胃3天麦冬多糖注射液，0.1mg/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(ip)大剂量组预先腹腔注射3天麦冬多糖注射液，0.2g/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(ip)中剂量组预先腹腔注射3天麦冬多糖注射液，0.06g/kg，每天1次。
麦冬多糖注射液(ip)小剂量组预先腹腔注射3天麦冬多糖注射液，0.02g/kg，每天1次。
第3天给药后1h进行冠状动脉左前降支结扎手术，造模成功者继续给药3天。第6天给药后1h通过Power/Lab4S型生物信号处理和分析系统测测定心功能及血流动力学指标，或取心脏作形态学观察(HE染色、NBT染色)，或取血清测定酶的活性。
3)血流动力学测定各组动物经腹腔注射戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站，批号860122)30mg/kg麻醉，舌下静脉注射肝素钠(常州千红制药有限公司，批号000830)1200u/kg，切开气管，插入气管插管。分离右侧颈总动脉，插入心导管，心导管的输出端连接高精度压力换能器(MLT1050型)，心导管在颈总动脉中记录动脉血压，连续稳定记录10min后，将心导管推入至左心室，记录左心室内压(LVSP、LVDP、LVEDP)、左室内压变化速率(LVdp/dt)曲线、外周血压(SAP、DAP、MAP)和心率(HR)。
4)血清酶学和氧自由基测定从各组动物的股动脉抽血5ml，静置2小时，离心(2,000rpm)5分钟，取上清液保存在-70℃。测定血清酶时，样品完全解冻样品后，根据试剂盒的说明通过722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)测定血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。测定CK时样品的用量为20μl，LDH为4μl、SOD为7μl、MDA为100μl。CK试剂盒(批号20011124)、SOD试剂盒(批号20020221)、MDA试剂盒(批号20020205)均购于南京建成生物工程研究所，LDH试剂盒(批号20010401)购于卫生部上海生物制品研究所。
5)心脏NBT染色新鲜心脏沿冠脉沟剪去心房，剔除血管、脂肪等非心肌组织，，称湿重。置-4℃冷冻约1h后取出，沿房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片，用生理盐水冲洗干净后放入0.1％的NBT(AMRESCO)溶液中，在37℃水浴条件下染色10min，染色后立即用蒸馏水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，梗死区染成蓝紫色，剪下梗死心肌，用滤纸吸去水分，称湿重，以梗死区湿重占心室湿重的百分比表示心肌梗死面积。
6)心脏形态学打开大鼠胸腔，迅速取出心脏，经生理盐水冲洗除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用滤纸吸去水分，置入10％中性甲醛溶液中固定，24小时后，行石蜡包埋、切片、染色，置光学显微镜下作心肌形态学观察。
7)统计分析全部实验结果均以均数±标准误或标准差表示。用学生t-检验或one way ANOVA检验比较组间数据的显著性，P值小于0.05，表示具有显著性意2.结果2.1麦冬多糖注射液对垂体后叶素所致大鼠急性冠脉痉挛的作用应用ST段抬高的幅度作为指标，空白对照组静脉注射垂体后叶素0～30sec后，ST段抬高的幅度明显增加(表1)，硝酸甘油和麦冬多糖注射液能够有效地抑制垂体后叶素所致ST段抬高。在30sec～10minST段，各组间比较，无显著性差异。表1.麦冬多糖注射液对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血心电图ST段的影响(x±s)
ST段位移值(μv)组别 列数0s～30s 30s～10m空白对照组10110.6±23.2 42.4±17.0硝酸甘油组1046.8±20.1**25.6±10.3*麦冬多糖注射液(po)大剂量组1051.2±18.8**33.8±19.6麦冬多糖注射液(po)中剂量组1069.2±13.1**37.6±15.7麦冬多糖注射液(po)小剂量组1065.2±9.0**28.3±13.2麦冬多糖注射液(iv)大剂量组1064.0±22.1**26.3±18.5麦冬多糖注射液(iv)中剂量组1056.2±20.8**27.3±15.4麦冬多糖注射液(iv)小剂量组1056.0±21.2**18.9±10.2*注与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2 HS-4冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血(梗塞)的作用1)心肌梗塞面积的变化心肌经NBT染色，发现假手术组心肌组织未见心肌梗塞的现象。大鼠经结扎冠状动脉3天，心肌梗塞的面积为25％左右，阳性对照药普奈洛尔能够缩小心肌梗塞的范围，应用不同浓度不同给药方式的麦冬多糖注射液处理，对减小心肌梗塞的范围具有一定的效果。(见表2)。表2.麦冬多糖注射液对急性心肌梗塞大鼠心肌梗塞面积的影响(x±s)组别 列数 心肌梗塞面积(％)心肌梗塞组625.57±2.83普萘洛尔组619.88±3.60麦冬多糖注射液(po)大剂量组623.78±3.29麦冬多糖注射液(po)中剂量组621.15±2.65#麦冬多糖注射液(po)小剂量组623.25±4.07麦冬多糖注射液(ip)大剂量组620.08±2.25##麦冬多糖注射液(ip)中剂量组619.50±0.98##麦冬多糖注射液(ip)小剂量组623.10±3.61注与心肌梗塞组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
2)心功能及血流动力学a)对心功能的影响假手术组大鼠比较，心梗组大鼠的LVSP、LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax各项指标明显下降(P＜0.01)。普奈洛尔组大鼠的心功能参数与心梗组比较，除LVEDP有差异(P＜0.05)外，其它各项无显著性差异。麦冬多糖注射液各组大鼠的的血流动力学参数与心梗组比较，对LVSP的下降有一定的改善作用(P＜0.01)，但对反应心肌收缩性能的主要指标+dp/dtmax影响不大，仅麦冬多糖注射液(ip)中剂量组可显著升高+dp/dtmax值(P＜0.05)；麦冬多糖注射液(po)三组有改善心肌顺应性(LVEDP的降低)的趋势，但与心梗组比较，仅麦冬多糖注射液(po)中剂量组有明显差异(P＜0.01)，麦冬多糖注射液(ip)三组对LVEDP的抬高无影响。
b)对血压、心率的影响 急性心肌缺血造成外周血压的下降，心梗组大鼠与与假手术组比较，除收缩压(SAP)有显著性差异(P＜0.05)外，舒张压(DAP)和平均压(MAP)无差异。心梗组大鼠的心率与假手术组比较，明显减弱(P＜0.01)。普奈洛尔组大鼠的血压和心率变化与心梗组比较，无显著性差异。麦冬多糖注射液各组的血压与心梗组比较，均无明显差异；在心率方面，麦冬多糖注射液(po)各组能够抑制心肌缺血造成的心率减慢(P＜0.05)。
表3.1 麦冬多糖注射液(po)对急性心肌缺血大鼠(n＝10)心功能(x±s)的影响麦冬多糖注射液(po)指标 ShamAMI Pro大剂量 中剂量 小剂量LVSP(mmHg) 179.4±12.4 143.1±15.8**136.7±14.6 164.2±13.6##153.2±14.4160.9±10.7##LVDP(mmHg) -11.4±3.1 2.7±2.8**0.4±4.2 -4.7±3.7##-4.6±4.9##-4.9±3.5##LVEDP(mmHg) 6.2±2.514.1±2.6**11.3±1.7#12.2±2.69.8±2.2##12.9±2.4±dp/dt(mmHg/s) 7721.8±749.3 4986.9±781.6**4711.0±591.2 5492.3±596.9 5584.8±651.2 5248.7±712.9-dp/dt(mmHg/s) -5083.5±557.3 -3298.8±691.6**-3182.5±638.5-3497.3±412.2 -3741.8±371.9 -3502.7±567.4注与Sham组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
表3.2麦冬多糖注射液(ip)对急性心肌缺血大鼠(n＝10)心功能(x±s)的影响麦冬多糖注射液(ip)指标Sham AMIPro大剂量 中剂量 小剂量LVSP(mmHg) 179.4±12.4143.1±15.8**136.7±14.6161.0±10.1##161.2±9.0##151.4±16.7LVDP(mmHg) -11.4±3.1 2.7±2.8**0.4±4.2 0.9±3.7 1.2±3.72.8±3.9LVEDP(mmHg) 6.2±2.5 14.1±2.6**11.3±1.7#14.8±4.9 12.5±3.4 15.1±3.6+dp/dt(mmHg/s) 7721.8±749.3 4986.9±781.6**4711.0±591.2 5415.6±542.8 5628.6±500.6#5183.8±977.6-dp/dt(mmHg/s) -5083.5±557.3 -3298.8±691.6**-3182.5±638.5 -3542.9±450.4 -3618.2±474.0 -3018.8±668.1注与Sham组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
表4.1麦冬多糖注射液(po)对急性心肌缺血大鼠(n＝10)血压和心率(x±s)的影响麦冬多糖注射液(po)指标 Sham AMI Pro大剂量中剂量小剂量SAP(mmHg)147.3±15.6130.6±16.1*124.3±11.4 140.7±9.5136.4±103136.9±7.5DAP(mmHg)106.2±13.898.7±14.391.9±10.8108.4±8.399.8±6.8 102.2±6.8MAP(mmHg)120.6±12.2109.3±14.5 102.8±11.4 118.4±7.7112.0±7.1116.2±6.4HR(b/min)421.0±24.7384.6±20.4**317.4±26.0 406.7±23.2#406.5±24.4#415.7±27.0##注与Sham组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
表4.2麦冬多糖注射液(ip)对急性心肌缺血大鼠(n＝10)血压和心率(x±s)的影响麦冬多糖注射液(ip)指标 Sham AMI Pro大剂量中剂量小剂量SAP(mmHg)147.3±15.6130.6±16.1*124.3±11.4142.5±9.6139.6±6.0129.5±11.4DAP(mmHg)106.2±13.898.7±14.391.9±10.8 104.6±7.2102.3±5.997.9±13.2MAP(mmHg)120.6±12.2109.3±14.5 102.8±11.4117.4±8.0115.2±5.6109.5±12.2HR(b/min)421.0±24.7384.6±20.4**317.4±26.0397.8±31.6 396.9±27.3 358.8±25.5注与Sham组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
3)血清酶的活性和氧自由基当心肌缺血向心肌坏死发展时，也就是可逆性病变向不可逆性病变发展时，心肌细胞膜通透性增加，心肌酶释放明显增加，使血清中酶的含量增高。血清中CK和LDH活性的增加，说明心肌已出现不可逆损伤。从表4中可见，心梗组大鼠血清CK和LDH活性与假手术组比较，明显增加(P＜0.01)。普奈洛尔不能抑制心肌缺血造成血清中CK和LDH活性的增加。麦冬多糖注射液(po)中剂量组和麦冬多糖注射液(ip)中剂量组均能显著(P＜0.01)抑制心肌缺血时血清中CK活性的增加，麦冬多糖注射液(ip)大剂量组的效果次之(P＜0.05)；而在抑制心肌缺血造成血清LDH增加方面，麦冬多糖注射液(po)各组和麦冬多糖注射液(ip)大剂量组的作用显著。
急性心肌缺血时，氧自由基生成增加导致SOD的消耗增加，并引起膜磷脂发生脂质过氧化，造成膜的损伤，大量的脂质过氧化的终末产物MDA产生增加。从表5中可见，急性心肌缺血后，SOD的活性明显降低和MDA的生成明显增加。普奈洛尔不能改善心肌缺血造成的SOD的降低和MDA的增加。麦冬多糖注射液(po)中剂量组和麦冬多糖注射液(ip)中剂量组对心肌缺血造成的SOD降低有明显抑制作用，麦冬多糖注射液(po)中剂量组能显著抑制MDA增加，而其它各组对SOD降低和MDA增加的影响不大。表5.麦冬多糖注射液对急性心肌缺血大鼠血清酶活性(x±s)的影响组别n CK(U/ml) LDH(IU/L)Sham10185.82±24.97 451.35±165.27AMI 10309.59±57.11**779.13±145.59**Pro 10303.55±75.00 743.33±100.42麦冬多糖注射液(po)大剂量10254.86±81.49 538.30±171.17##麦冬多糖注射液(po)中剂量10212.86±60.82##469.84±160.35##麦冬多糖注射液(po)小剂量10278.72±50.56 598.30±162.31#麦冬多糖注射液(ip)大剂量10230.04±93.91#479.01±189.86#麦冬多糖注射液(ip)中剂量10201.41±83.66##645.91±232.63麦冬多糖注射液(ip)小剂量10282.86±105.11 764.48±387.64注与Sham组相比，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
表6.HS-4对急性心肌缺血大鼠血清SOD和MDA(x±s)的影响组别nSOD(NU/ml) MDA(nmol/ml)Sham10 478.59±53.432.26±0.77AMI 10 363.73±50.73**3.24±0.93*Pro 10 340.24±36.593.38±1.173麦冬多糖注射液(po)大剂量10 389.84±52.393.15±0.99麦冬多糖注射液(po)中剂量10 473.37±41.65##2.37±0.74#麦冬多糖注射液(po)小剂量10 363.44±46.873.49±0.70麦冬多糖注射液(ip)大剂量10 399.70±36.562.80±0.54麦冬多糖注射液(ip)中剂量10 414.20±55.10#2.78±0.87麦冬多糖注射液(ip)小剂量10 374.17±65.703.33±0.80注与Sham组相比，**P＜0.01；与AMI组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
4)心肌组织病理学分析心肌组织经固定、包埋、切片和HE染色，观察其病变程度。心肌坏死灶病变程度判别标准-心肌组织未见坏死灶；+病灶内心肌未全部坏死，其中夹杂少量未坏死的心肌细胞；++病灶内心肌细胞全部发生凝固性坏死或溶解性坏死。
假手术组(n＝4)心肌组织未见病变(-)，心外膜有轻度炎症反应或无，见少量中性粒细胞和单个核细胞浸润。
模型组心肌的范围为35.0±4.1％(n＝4)，梗塞灶呈地图状，病灶内大片心肌细胞溶解或部分溶解，伴大量单个核细胞浸润及少量中性粒细胞浸润，溶解坏死区之间可见大片凝固性坏死灶，该区细胞核已溶解或固缩，仅剩细胞轮廓(++)；心外膜未见明显异常。
阳性对照药普奈洛尔组心肌梗塞的范围为38.8±4.8％(n＝4)，病变中有1例溶解坏死区之间的心肌细胞大部分尚存活(+)，其它3例同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(po)大剂量组心肌梗塞的范围为26.3±7.5％(n＝4)，病变中有1例病变程度为+，部分溶解坏死区域尚有存活的心肌细胞，另3例同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(po)中剂量组心肌梗塞的范围为30.0±9.1％(n＝4)，病变同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(po)小剂量组心肌梗塞的范围为38.8±2.5％，病变同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(ip)大剂量组心肌梗塞范围为16.3±7.5％(n＝4)，病变同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(ip)中剂量组心肌梗塞范围为28.8±6.3％(n＝4)，病变中有1例病变程度为+，部分溶解坏死区域尚有存活的心肌细胞，另3例同模型组(++)。
麦冬多糖注射液(ip)小剂量组心肌梗塞范围为36.3±10.3％(n＝4)，病变同模型组(++)。
3.小结垂体后叶素可使冠状动脉发生急性痉挛，造成急性供血不足和外周阻力增加，导致心脏负荷加重，在心电图上可见反映心肌缺血的T波抬高和S-T段抬高。当结扎动物冠脉时，心电图的S-T段抬高可作为心肌梗塞的一项重要指标。本实验结果表明麦冬多糖注射液可拮抗垂体后叶素引起的T波抬高和S-T段抬高，可使结扎大鼠冠脉后升高的S-T段明显降低，说明麦冬多糖注射液具有抗急性心肌缺血的作用，其机制可能涉及到冠脉扩张和冠脉流量的增加。
以NBT大体标本染色法测定心肌梗塞面积表明不同给药途径、不同剂量的麦冬多糖注射液对由冠脉结扎造成的心肌梗塞的范围有一定的减小作用。HE染色的心肌组织病理学分析表明冠脉结扎造成的心肌缺血后，光镜下心肌组织下有明显的心肌细胞变性、坏死变化。梗塞灶内大片心肌细胞溶解或部分溶解，伴大量单个核细胞浸润及少量中性粒细胞浸润。经麦冬多糖注射液处理的动物的心肌组织的变性和坏死程度减轻不明显。心肌缺血时的心肌收缩力减弱是最早的现象，其发生机制主要是由于代谢障碍所致的ATP减少，细胞内钾丢失，无机磷酸盐增多，细胞内酸中毒，导致心肌兴奋-收缩偶联障碍。麦冬多糖注射液有改善急性心肌缺血所造成的收缩性能的下降和改善心肌的顺应性(LVEDP的降低)的趋势，但效果不明显。一般而言，心肌缺血6个小时后，血清中CK和LDH活性的增加，当心肌缺血向心肌坏死发展时，也就是可逆性病变向不可逆性病变发展时，心肌细胞膜通透性增加，心肌酶释放明显增加，使血清中酶的含量增高。血清中CK和LDH活性的增加，说明心肌已出现不可逆损伤。麦冬多糖注射液能够降低冠脉结扎动物血清中CK和LDH含量升高，提示麦冬多糖注射液可保护心肌细胞，增加细胞的抗缺血缺氧能力，提高膜的稳定性，防止心肌的进一步坏死。急性心肌缺血时，氧自由基生成增加导致SOD的消耗增加，并引起膜磷脂发生脂质过氧化，造成膜的损伤，大量的脂质过氧化的终末产物MDA产生增加。麦冬多糖注射液对心肌缺血造成的SOD降低和MDA增加有一定的抑制作用，说明麦冬多糖注射液具有抑制心肌缺血造成的自由基生成增加和清除氧自由基的作用。
本发明公开的麦冬多糖MDG-1，抗心肌缺血作用显著，提供了一种具有药用价值的活性多糖。
图1 MDG-1高效液相法纯度图谱图2 MDG-1乙酰化得糖醇的乙酰化衍生物气相3 标准糖气相图谱图4 MDG-1 KBr压片法红外图谱图5 MDG-113CNMR谱图6 MDG-11H NMR谱图7 MDG-1完全甲基化后气相8 MDG-1氧化、Smith降解后气相图
具体实施例方式实施例1 麦冬多糖MDG-1的制备1.麦冬多糖的提取取干燥麦冬块根1kg，5-6倍量80％乙醇回流3次，每次1小时，药渣水提2-3次，每次30分钟。水提液减压浓缩至1g/ml，加入95％乙醇至含醇量达70％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬多糖粉末。
2.麦冬多糖的超滤分离麦冬总多糖，稀释15倍，10000分子量膜超滤，压力为3.5大气压，超滤液70℃浓缩后，冷冻干燥。
3.麦冬多糖的纯化取麦冬多糖2g，少量水溶解，上DEAE SepharoseFF柱，水、0.1-4molNacl梯度洗脱，蒽酮-硫酸法在线检测，收集水洗部分峰位，冷冻干燥后，水溶解上SephadexG50柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，再上SephadexG25柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，得到白色粉末。
4.纯化多糖的纯度鉴定采用高效液相法色谱条件SHODEX KS802色谱柱，流动相为水，流速1ml/min，柱温80℃，检测器为ELSD。多糖用适量水溶解，进样，呈单一对称峰，见图1。实施例2、麦冬多糖MDG-1结构测定(1)糖组分分解(全水解)样品MDG-1经2M三氟乙酸110℃封管水解1h，水解液减压浓缩至干，然后再反复加甲醇二次，再蒸干。溶于少量水，水溶液分为A和B两部分。A部分点样进行纤维素薄板层析，并用标准单糖作对照，结果发现水解液只有一个斑点，其Rf值与果糖一致，由此推测MDG-1可能是由果糖组成的果聚糖。B部分用NaBH4还原，醋酸中和，减压浓缩蒸干，再反复加甲醇二次，再蒸干，然后乙酰化得糖醇的乙酰化衍生物，进行气相层析，结果如图2所示，与标准图谱(图3)比较，分别对应于葡萄糖和甘露糖。由于果聚糖呈呋喃型酮糖环，经水解还原后会发生差向异构化，生成葡萄糖醇和甘露糖醇。根据薄板层析的结果可以认为该多糖是呋喃型果聚糖。当然其最终结果还要经NMR证实。
(2)红外吸收光谱样品采用KBr压片法测定，结果如图4所示，从IR图中MDG-1呈现典型的多糖的吸收特征，在波数933cm-1和820cm-1的吸收峰为果聚糖特油的吸收信号，由此可见该多糖为—果聚糖。
(3)核磁共振光谱1H及13CNMR谱的分析样品溶于D2O中，常温下测定，结果见图5，6。从13CNMR谱可见(图5)异头碳信号在103-104ppm，说明异头碳均呈β构型，参照文献数据对各信号归属如下LINKAGESC-1 C-2 C-3 C-4C-5 C-6Fruf(2→60.8104.176.874.7 81.562.8→1)Fruf(2→62.6103.676.874.7 81.562.8→6)Fruf(2→60.6104.276.874.7 80.563.51，6)Fruf(2→ 60.8104.176.874.7 80.563.51H谱(图6)中在异头氢区无强信号，这再次说明该多糖为果聚糖，因为果糖是酮糖，其2位异头碳上没有质子，氢谱中有一个较弱的异头信号，可能来源于果聚糖中常见的还原末端连接的α-D-Glc。
(4)甲基化反应称取干燥的MDG-1样品约8mg于反应瓶中，加入干燥过的DMSO2ml于室温磁力搅拌，溶解后加入粉末状干燥的NaOH粉末20mg，室温搅拌10min，然后再在冰浴中搅拌10min，慢慢加入0.6mlCH3I，反应30min，反应液减压浓缩去过量的CH3I，对水透析，透析液冷冻干燥，反应重复三次，直至IR显示甲基化完全。
MDG-1完全甲基化后，水解为部分甲基化的单糖，经还原乙酰转化为部分甲基化的糖醇乙酸酯，进行GC-MS分析，结果出现八个峰(图7)，该八个峰可分为四组，这是由于一定连接键型觉得果糖在还原时转变成相应的甘露糖醇和葡萄糖醇的衍生物，所以每个部分甲基化的果糖在GC中出现两个峰，两者之和代表组分的含量。甲基化分析的结果可知该多糖主要由2→1及2→6连接的果糖组成。
(5)过碘酸盐氧化反应与Smith降解反应样品MDG-1溶于0.015M NaIO4中，于20℃以下室温反应数天，间隔24h用分光光度法OD224测定NaIO4消耗，结果发现氧化反应于第三天完全。结果表明过碘酸盐氧化平均每摩尔己糖残基消耗过碘酸钠0.93ml，由此说明果糖的3及4位羟基没有发生取代，进一步说明该多糖以2→1或2→6连接为主。将上述氧化完全的样品进行Smith降解，即将氧化完全的样品用NaIO4还原10h，醋酸中和，透析，冷冻干燥，然后水解，乙酰化，GC分析，结果如图8所示，从结果可见主要产物为丙三醇，丙三醇是邻二元醇化合物降解产物，说明氧化发生在3，4位的邻位羟基之间，进一步证明该多糖主要由2→1及2→6连接的呋喃型果糖组成。
权利要求
1.一种麦冬多糖，其特征在于该多糖是分子量为5000的β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端与α-D-Glc相连。
2.一种如权利要求1所述的麦冬多糖的制备方法，其特征在于所述多糖的制备包括下列步骤1)麦冬多糖的提取取干燥麦冬块根，压扁用5-6倍量70％-95％乙醇回流3次，弃之，药渣水提2-3次，水提液减压浓缩至0.5-1g/ml，加入75％-95％乙醇至含醇量达60％-80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色麦冬多糖粉末，得率20％左右；2)麦冬多糖的超滤分离麦冬总多糖，用水稀释15倍，10000分子量膜超滤，压力为3.5大气压，超滤液70℃浓缩后，冷冻干燥；3)麦冬多糖的纯化取麦冬多糖，少量水溶解，上DEAE SepharoseFF柱，水、0.1-4molNacl梯度洗脱，蒽酮-硫酸法在线检测，收集水洗部分峰位，冷冻干燥后，水溶解上SephadexG50柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，再上SephadexG25柱，水洗脱，合并峰位，冷冻干燥，得到白色粉末，即为麦冬多糖MDG-1。
3.一种如权利要求2所述的麦冬多糖的制备方法，其特征在于经提取获得的麦冬多糖粉末，超滤分离后，分别经DEAE SepharoseFF柱、SephadexG50柱和SephadexG25柱纯化。
4.一种如权利要求1所述的麦冬多糖在制备治疗抗心肌缺血药物中的应用。
5.一种如权利要求4所述的麦冬多糖的应用，其特征在于该多糖作为活性成分用于制备抗心肌缺血的药物。
全文摘要
本发明涉及具有抗心肌缺血作用的麦冬多糖MDG－1及其方法和应用。本发明公开的经分离纯化获得的麦冬多糖MDG－1是分子量为5000的β－D－果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)，该多糖的还原端与α－D－Glc相连。本发明公开的麦冬多糖MDG－1，抗心肌缺血作用显著，是一种具有药用价值的活性多糖。
文档编号C08B37/00GK1445244SQ03115730
公开日2003年10月1日 申请日期2003年3月11日 优先权日2003年3月11日
发明者徐德生, 冯怡, 沈岚, 林晓 申请人:上海中医药大学附属曙光医院