专利名称：一种粒毛盘菌及其胞外多糖和在降脂利肝药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于粒毛盘菌及其胞外多糖的应用技术领域，具体涉及粒毛盘菌YM-281 及其胞外多糖和在制备降脂利肝药物中的应用。
背景技术：
随着人们生活水平的不断提高，高脂食物的摄入逐渐增加，动脉粥样硬化、脂肪肝及心脑血管病等疾病发病率逐年上升。而据《食品胶体》(Food Hydrocolloids,2005,19 813-819)介绍，高脂(血脂、肝脂)是动脉粥样硬化、心脑血管疾病的主要成因。另据《中华中医药刊》(2010,28(8) :1738-1740)介绍，高脂对肝脏有潜在的损害，会导致肝损伤和功能异常。临床上常采用贝特类药物和他汀类药物预防和治疗高脂症，但据《中国动脉硬化杂志》O003，ll(3) :223-226)介绍，这些药物有一定的副作用，且对高血脂、高肝脂造成的肝组织损伤无缓解和治疗作用；另外现有的贝特类药物和他汀类药物价格较高。天然药物多数不含对人体有害的成分，无毒副作用，因此开发低毒高效且价格经济的天然降脂(血脂、肝脂)利肝药物一直以来备受关注。粒毛盘菌属(Lachnum Retz.)是分布于世界各地的一类腐生性真菌，近几年来本发明人课题组研究发现粒毛盘菌具有重要的经济价值。本发明课题组发表于《浙江大学学报》Q009，；35 :153-157)及《碳水聚合物》(Carbohydrate Polymers, 2011,86 :285-290)的论文中报道了粒毛盘菌一些菌株在深层培养条件下能够产生大量的活性多糖，具有较强的抗氧化、降血糖等活性。中国专利申请号200910145058. 4公开了本发明人课题组的《一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法》，是利用一株保藏编号为CCTCC No =M 209193的粒毛盘菌 YM-223(本发明人课题组自定编号代码如肌叫-223的缩写)制备黑色素，该菌株既能产生胞外黑色素也能产生胞内黑色素；中国专利申请号20111007M69. 2介绍了本发明人课题组的《一株辛格粒毛盘菌及其液态发酵制备胞内黑色素的方法》，利用另一株保藏编号为 CCTCC No =M 2011054的辛格粒毛盘菌YM-292制备胞内黑色素。但目前国内外尚未见到关于新菌株粒毛盘菌YM-281 (本发明人课题组自定编号代码kMing-281的缩写)及由其制备的胞外多糖具有降脂利肝作用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新菌株粒毛盘菌YM-281和由其制备胞外多糖及该胞外多糖在制备降脂利肝药物中的用途，以满足人们对降脂利肝药物的需要。本发明的粒毛盘菌YM481菌株，该生物材料的样品保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院(邮政编码430072)，保藏存活日期为2011年6月18日；保藏编号为CCTCC No =M 2011196，分类命名为粒毛盘菌 YM-281(Lachnum sp. YM-281)。
本发明由粒毛盘菌YM-281菌株制备胞外多糖的方法，其特征在于将保藏编号为 CCTCC No :M 2011196的粒毛盘菌YM-281 (Lachnum sp. YM-281)菌株接种于固体活化培养基上2548°C活化6-8天，该固体活化培养基由20-25g/L葡萄糖，蛋白胨4_6g/L，4_6g/L 酵母膏，14-16g/L琼脂组成；再将活化的粒毛盘菌YM-281接种于装有100_125mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在M-25°C以180-200r/min恒温震荡培养3_4天，作为大罐发酵的种子液，该发酵培养基由葡萄糖45-47g/L、酵母膏14-15g/L、甘氨酸6-7mg/L、0. 9-1. lg/L MgSO4 · 7H20 和 0. 9-1. lg/L KH2PO4 组成，并以 0. 3-0. 5mol/L 的 NaOH 溶液调节其初始 pH 在 7. 0-8.0 ；然后在发酵罐中装入4L发酵培养基，接入14-16%体积的种子液，控制培养温度为24-15°C，通气量为0. 9-1. lL/min，搅拌转速为160-180r/min，发酵8_10天后，将发酵液抽滤，浓缩到原来体积的1/5，再加入浓缩液3-4倍体积的90% -100%乙醇水溶液，摇勻后于4°C静止12-1他，然后将离心分离得到的沉淀物用无水乙醇和丙酮分别抽滤洗涤3-4遍， 然后用蒸馏水将沉淀物溶解，再经赛沃杰(Sevage)法脱蛋白，然后按脱蛋白后的多糖溶液 1/3-1/2体积加入质量百分浓度为30% -50%的H2A于50_55°C下保温脱色，将脱色后的多糖溶液置于截留分子量为3500Da的透析袋内，先于流水、再在蒸馏水中分别透析M_30h， 透析后的溶液经真空冷冻干燥，即得到粒毛盘菌YM-281胞外多糖粉末；其中所述赛沃杰 (Sevage)法脱蛋白的操作如下在粗多糖溶液中加入按其体积1/3的氯仿与正丁醇体积比为5 1的混合液(Sevage试剂)，将该混合物剧烈振摇20-30min，装入分液漏斗中静止 20-30min，等到蛋白质变性成胶状存在于水相与溶剂相的交界面上，分去溶剂相(下层相) 及水相和溶剂相交界处的变性蛋白；重复操作至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质为止，所得水相溶液(上层相)即为脱蛋白后的粗粒毛盘菌YM-281胞外多糖溶液。通过将所制备的粒毛盘菌YM-281胞外多糖进行小鼠降脂利肝作用的药理实验， 确认其具有降脂利肝作用，并确定其有效剂量在给药剂量为150-300mg/(kg bw)时显著降低高脂小鼠血清脂质、肝脏脂质水平及动脉粥样化指数，增加血清高密度脂蛋白胆固醇水平及粪便脂质排泄量；给药剂量为75-300mg/(kg bw)显著降低高脂小鼠血清转氨酶活性及肝组织丙二醛含量，增加肝组织超氧歧化酶活性的；具有明显的降血脂、降肝脂，治疗高脂造成肝损伤和功能异常的作用，无毒副作用，可制成片剂或胶囊供临床使用。本发明的粒毛盘菌YM-281胞外多糖在制备降脂利肝药物中的用途，其特征在于 按300-600g的粒毛盘菌YM-281胞外多糖，与药用辅料稀释剂200_250g和助流剂30_60g 混勻后，再与250-600mL乙醇混合均勻制得软材，将该软材过筛得到的湿颗粒干燥后整粒， 最后加入润滑剂3-10g混勻后压片，制成片剂1000片；或者按药用辅料稀释剂200-270g、 助流剂40-70g和润湿剂3-6g混勻后，与300-600g的粒毛盘菌YM-281胞外多糖混合均勻后分装入1000粒1#空心胶囊内，制得胶囊剂1000粒；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。本发明推荐的片剂加工的优选例为取过80 100目筛的粒毛盘菌YM-281胞外多糖500g、稀释剂糊精250g、助流剂滑石粉40g混合均勻后加300-500mL乙醇混合均勻制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁IOg混勻后压片，制成1000片，片重0. 8g，多糖含量0. 5g/片。本发明推荐的胶囊剂加工优选例为取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉45g，润湿剂十二烷基硫酸钠5g混合均勻再与500g粒毛盘菌YM-281胞外多糖混合均勻后装1#空心胶囊1000粒，多糖含量0. 5g/粒。本发明中制备粒毛盘菌YM-281胞外多糖方法中的该多糖发酵、提取及纯化条件均是经本发明课题组发明人进行试验研究优化归纳所获得的，在这些条件下制备粒毛盘菌 YM-281胞外多糖的产量较大。本发明中对粒毛盘菌YM-281胞外多糖进行药效学实验，给药剂量在150-300mg/ (kg bw)范围内该多糖对高脂小鼠有显著的降低血清脂质、肝脏脂质水平动及脉粥样化指数，增加血清高密度脂蛋白胆固醇水平及粪便脂质排泄量，量效关系良好；给药剂量在 75-300mg/(kg bw)范围内时，该多糖对高脂小鼠有显著的降低血清转氨酶活性及肝组织丙二醛含量，增加肝组织超氧歧化酶活性，且呈良好的量效关系；表明粒毛盘菌YM-281胞外多糖具有明显的降血脂、降肝脂，治疗高脂造成肝损伤功能异常的作用，而且无毒副作用。本发明采用粒毛盘菌YM-281胞外多糖所制备的口服制剂克服了贝特类药物和他汀类药物有一定的副作用，价格偏高，且对高脂血脂、高肝脂造成的肝组织损伤无缓解和治疗作用等缺点。实验研究证实，本发明的粒毛盘菌YM-281胞外多糖不仅能有效的降血脂、 降肝脂、缓解和治疗高脂引起肝损伤和肝功能异常，且无毒副作用、制备方法简单经济。
图1是正常对照组小鼠肝组织病理切片图；图2是高脂对照组小鼠肝组织病理切片图；图3是粒毛盘菌YM-281胞外多糖300mg/ (kg bw)组小鼠肝组织病理切片图；图4是粒毛盘菌YM-281胞外多糖150mg/ (kg bw)组小鼠肝组织病理切片图；
图5是粒毛盘菌YM-281胞外多糖75mg/ (kg bw)组小鼠肝组织病理切片图；图6是辛他伐汀对照组小鼠肝组织病理切片图。
具体实施例方式实施例1 粒毛盘菌YM-281胞外多糖制备本实施例中粒毛盘菌YM-281胞外多糖的制备过程如下将保藏编号为CCTCC No =M 2011196的粒毛盘菌YM-281菌株菌株接种于固体活化培养基上2548°C活化6-8天，该固体活化培养基由20-25g/L葡萄糖，蛋白胨4_6g/L， 4-6g/L酵母膏，14-16g/L琼脂组成；再将活化的粒毛盘菌YM-281接种于装有100_125mL 发酵培养基的250mL三角瓶中，在M-25°C以180-200r/min恒温震荡培养3_4天，作为大罐发酵的种子液，该发酵培养基由葡萄糖45-47g/L、酵母膏14-15g/L、甘氨酸6-7mg/L、 0. 9-1. lg/L MgSO4 · 7H20 和 0· 9-1. lg/L KH2PO4 组成，并以 0. 3-0. 5mol/L 的 NaOH 溶液调节其初始PH在7. 0-8. 0 ；然后采用5L自控发酵罐液态深层发酵，发酵罐装入4L发酵培养基， 接种量为14-16%，培养温度为24-15°C，通气量为0. 9-1. lL/min，搅拌转速为160-180r/ min,发酵8-10天后将发酵液抽滤，浓缩到原来体积的1/5，加入按浓缩液3_4倍体积的 90% -100%乙醇水溶液，摇勻后于4°C静止12-18h，然后分装于离心管中5000r/min离心 8-12min，将离心沉淀物先用无水乙醇、再用丙酮抽滤洗涤3-4遍，然后用蒸馏水溶解沉淀物，再经赛沃杰(Sevage)法脱蛋白，然后按脱蛋白后的多糖溶液1/3-1/2体积加入质量百分浓度为30% -50%的H2A于50-55°C下保温脱色，然后将脱色后的多糖溶液置于截留分子量为3500Da的透析袋内，于流水、蒸馏水中分别透析M-30h，透析后的溶液经真空冷冻干燥，即得粒毛盘菌YM-281胞外多糖粉末。法脱蛋白为在粗多糖溶液中加入按其体积1/3量的氯仿与正丁醇体积比为5 1的混合试剂(Sevage试剂)，将该混合物剧烈振摇20-30min后，装入分液漏斗中静止20-30min，等到蛋白质变性成胶状存在于水相与溶剂相的交界面上，分去溶剂相及水相与溶剂相(下层相)交界处的变性蛋白。重复操作至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质为止，所得水相溶液(上层相)即为脱蛋白后的粗粒毛盘菌YM-281胞外多糖溶液。粒毛盘菌YM-281胞外多糖对小鼠降脂利肝的作用药理实验(1)动物昆明小鼠，雌雄各半，体重20 士 2g，随机分组。(2)试剂盒总胆固醇(TC)、甘油三酸酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧岐化酶 (SOD)、总胆汁酸(TBA)测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。(3)高脂饲料标准实验饲料78.6%，蛋黄10%，猪油10%，胆固醇1%，胆酸钠 0.2%,甲基硫氧嘧啶0. 2 %，拌勻，加水适量制成高脂饲料，烘干备用。(4)粒毛盘菌YM-281胞外多糖溶液的制备多糖粉末用0.9%生理盐水配制成 7. 5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL 的溶液，给药体积为 IOmL/(kg bw)。(5)方法小鼠于实验环境下适应性喂养一周后，随机分为6组粒毛盘菌YM-281 胞外多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、正常对照组、高脂对照组、阳性对照组，每组15 只。其中正常对照组给予常规饲料外，其余5组给予高脂饲料2周后，按剂量每天1次灌胃给予相应药物，给药体积均为1.0mL/100g bw，正常对照组及高脂对照组给予等体积生理盐水。正常对照组每天灌胃0.9%生理盐水，粒毛盘菌YM-281胞外多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组分别连续灌胃7. 5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL的多糖溶液，阳性对照组连续灌胃 0.8mg/mL辛伐他汀溶液，灌胃体积为1.0mL/(100g bw)。按照小鼠体重给予不同体积的受试物，自由摄食和饮水，连续灌喂4周。给药期间正常对照组给予常规饲料，其余5组仍给予高脂饲料。(6)相关指标测定血清中指标的测定各组小鼠末次灌胃前均禁食12h，末次灌胃Ih后，称体重，摘除眼球取血，于 40C 4000r/min离心IOmin分离出血清，冰箱保存(_20°C )、备测。使用相应试剂盒测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酸酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性，具体操作按测定试剂盒说明书。 动脉粥样化指数(Al)按AI = (TC-(HDL-C))/HDL-C计算。肝组织中指标的测定小鼠摘除眼球取血后，解剖取肝脏，生理盐水漂洗，滤纸吸干，称重，冰箱保存 (_80°C)、备测。肝脏系数按如下公式计算，肝脏指系数(g/100g bw)=肝脏质量(g)/体重 (IOOg)。然后测定肝组织中总胆固醇(TC)、甘油三酸酯(TG)、丙二醛(MDA)含量及超氧歧化酶(SOD)活性。具体操作按总胆固醇、甘油三酸酯、丙二醛及超氧歧化酶测定试剂盒说明书。肝组织真空冷冻干燥后研磨粉碎，然后采用索式提取法测定肝脏脂肪含量。小鼠粪便中胆汁酸、总胆固醇及脂肪排泄量的测定收集给药期最后3天的小鼠粪便，真空冷冻干燥，称重，密封保存，备测。然后将干燥小鼠粪便研磨粉碎，测定小鼠粪便中总胆汁酸和总胆固醇含量，具体操作按总胆汁酸、 总胆固醇测定试剂盒说明书；取粪便干粉2g，加入20mL氯仿-甲醇溶液浸提M小时，然后 4000r/min离心IOmin分离出上清液，上清液用无水硫酸钠Qg)干燥，然后用氮气吹干，称量残留下的脂肪。总胆汁酸(TC或脂肪)排泄量(mg/mOUSe/3dayS)=粪便质量X总胆汁酸(TC或脂肪)含量。小鼠肝组织病理切片观察新鲜肝组织块QCmX2CmX0. 2 0. 3cm)用OCT冷冻包埋剂包埋，用冷冻切片机切片(厚度为8 μ m)，切片放入10%的福尔马林溶液固定lmin，进行常规HE染色，用光学显微镜下观察、拍照。(7)粒毛盘菌YM-281胞外多糖对小鼠降脂利肝的作用药理实验结果粒毛盘菌YM-281胞外多糖对高脂饮食所致高脂小鼠的血清中脂质含量升高的抑制作用如表1所示。高脂对照组小鼠血清Tc、TG、LDL-C及动脉粥样化指数(Al)均显著高于正常对照组，而HDL-C与正常对照组无显著差异。给药4周后，与高脂对照组相比，高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C含量及AI显著降低，血清HDL-C含量显著增大，其中小鼠血清 TC和LDL-C与正常对照组相比均无显著差异(表1)。中、低剂量的粒毛盘菌YM-281胞外多糖亦能不同程度的降低高脂小鼠血清TC、TG、LDL-C含量及AI值，增大血清HDL-C含量， 量效关系较好。说明粒毛盘菌YM-281胞外多糖能有效降低高脂小鼠血清脂质水平，具有降血脂、抑制动脉粥样化的作用。粒毛盘菌YM-281胞外多糖对高脂小鼠肝组织中脂质代谢的影响如表2所示。高脂对照组小鼠肝脏TC、TG、脂肪含量显著大于正常对照组。给药4周后，高、中剂量组及阳性对照组小鼠肝脏TC、TG、脂肪含量均显著低于高脂对照组。LEP-Ib高剂量组小鼠肝脏TG 和脂肪含量与正常对照组相比无显著差异。高剂量组小鼠肝组织TC、TG及脂肪含量分别低于阳性对照组54. 29%,44. 70%和33. 63%。说明粒毛盘菌YM-281胞外多糖能有效降低高脂小鼠肝组织脂质水平，具有降肝脂，治疗脂肪肝之功效，量效关系良好，且效果优于阳性对照药物。表1.粒毛盘菌YM-281胞外多糖对高脂小鼠血清脂质代谢的影响(mean士SD， η ^ 10)
组别
正常对照组高脂对照组
阳性对照组
高剂量组中剂量组低剂量组
权利要求
1.一种粒毛盘菌YM-281 (Lachnum sp. YM-281)菌株，该生物材料的样品保藏编号为 CCTCC No :M 2011196。
2.—种由粒毛盘菌YM-281菌株制备胞外多糖的方法，其特征在于将保藏编号为 CCTCC No :M 2011196的粒毛盘菌YM-281 (Lachnum sp. YM-281)菌株接种于固体活化培养基上2548°C活化6-8天，该固体活化培养基由20-25g/L葡萄糖，蛋白胨4_6g/L，4_6g/L 酵母膏，14-16g/L琼脂组成；再将活化的粒毛盘菌YM-281接种于装有100_125mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在M-25°C以180-200r/min恒温震荡培养3_4天，作为大罐发酵的种子液，该发酵培养基由葡萄糖45-47g/L、酵母膏14-15g/L、甘氨酸6_7mg/L、0. 9-1. lg/L MgSO4 · 7H20 和 0. 9-1. lg/L KH2PO4 组成，并以 0. 3-0. 5mol/L 的 NaOH 溶液调节其初始 pH 在 7. 0-8.0 ；然后在发酵罐中装入4L发酵培养基，接入14-16%体积的种子液，控制培养温度为24-15°C，通气量为0. 9-1. lL/min，搅拌转速为160-180r/min，发酵8_10天后，将发酵液抽滤，浓缩到原来体积的1/5，再加入浓缩液3-4倍体积的90% -100%乙醇水溶液，摇勻后于4°C静止12-1他，然后将离心分离得到的沉淀物用无水乙醇和丙酮分别抽滤洗涤3-4遍， 然后用蒸馏水将沉淀物溶解，再经赛沃杰法脱蛋白，然后按脱蛋白后的多糖溶液1/3-1/2 体积加入质量百分浓度为30% -50%的H2A于50-55°C下保温脱色，将脱色后的多糖溶液置于截留分子量为3500Da的透析袋内，先于流水、再在蒸馏水中分别透析M-30h，透析后的溶液经真空冷冻干燥，即得到粒毛盘菌YM-281胞外多糖粉末；其中所述赛沃杰法脱蛋白的操作如下在粗多糖溶液中加入按其体积1/3的氯仿与正丁醇体积比为5 1的混合液， 将该混合物剧烈振摇20-30min，装入分液漏斗中静止20-30min，等到蛋白质变性成胶状存在于水相与溶剂相的交界面上，分去溶剂相及水相和溶剂相交界处的变性蛋白；重复操作至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质为止，所得水相溶液即为脱蛋白后的粗粒毛盘菌YM-281胞外多糖溶液。
3.权利要求2所述粒毛盘菌YM-281胞外多糖在制备降脂利肝药物中的用途，其特征在于按300-600g的粒毛盘菌YM-281胞外多糖，与药用辅料稀释剂200_250g和助流剂30-60g混勻后，再与250-600mL乙醇混合均勻制得软材，将该软材过筛得到的湿颗粒干燥后整粒，最后加入润滑剂3-10g混勻后压片，制成片剂1000片；或者按药用辅料稀释剂 200-270g、助流剂40-70g和润湿剂3_6g混勻后，与300-600g的粒毛盘菌YM-281胞外多糖混合均勻后分装入1000粒1#空心胶囊内，制得胶囊剂1000粒；所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。
4.如权利要求3所述粒毛盘菌YM-281胞外多糖在制备降脂利肝药物中的用途，其特征在于所述片剂加工为取过80 100目筛的粒毛盘菌YM-281胞外多糖500g、稀释剂糊精 250g、助流剂滑石粉40g混合均勻后加300-500mL乙醇混合均勻制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁IOg混勻后压片，制成1000片，片重0. 8g，多糖含量0. 5g/片。
5.如权利要求3所述粒毛盘菌YM-281胞外多糖在制备降脂利肝药物中的用途，其特征在于所述胶囊剂加工为取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉45g，润湿剂十二烷基硫酸钠 5g混合均勻再与500g粒毛盘菌YM-281胞外多糖混合均勻后装1#空心胶囊1000粒，多糖含量0. 5g/粒。
全文摘要
本发明公开了一种粒毛盘菌YM-281菌株及其胞外多糖和在制备降脂利肝药物中的应用，特征是将保藏编号为CCTCC NoM 2011196的粒毛盘菌YM-281菌株活化后，接种于发酵培养基，制得的粒毛盘菌YM-281胞外多糖，在给药剂量为150-300mg/(kg bw)时显著降低高脂小鼠血清脂质、肝脏脂质水平及动脉粥样化指数，增加血清高密度脂蛋白胆固醇水平及粪便脂质排泄量；给药剂量为75-300mg/(kg bw)显著降低高脂小鼠血清转氨酶活性及肝组织丙二醛含量，增加肝组织超氧歧化酶活性的；具有明显的降血脂、降肝脂，治疗高脂造成肝损伤和功能异常的作用，无毒副作用，可制成片剂或胶囊供临床使用。
文档编号A61P3/06GK102250778SQ20111018410
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者叶明 , 邱涛 申请人:合肥工业大学