专利名称：一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品，特别涉及一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的提取及制备方法。
背景技术：
近二十年来，人们一直研究应用于组织工程的生物材料。通常是将体外培养的高浓度的种子细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质载体上，并复合诱导因子，然后移植于体内，达到形成新的有功能的组织的目的[Noshi，T等人，“Artif Organs”，第25卷3期，第201-208页(2001)]。常用的组织工程材料按照来源可分为人工合成材料和天然材料两大类。人工合成材料包括目前已被广泛应用的羟基磷灰石(HA)，生物活性玻璃陶瓷(BGC)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)等，它们也常被复合运用而发挥更佳的效果。人工材料的优点是结构牢固，有适宜的生物力学强度，优良的骨传导性和较好的生物相容性。然而，与天然生物材料相比较，人工材料存在着成本较高，表面活性较差，不利于细胞黏附、分布与增殖，并有诱发免疫反应可能的缺陷。顾名思义，天然材料即是指天然存在的，从人体或动植物中获取的材料，如胶原(collagen)、松质骨等，这类材料抗原性弱，组织亲和性和结合力良好，其天然的孔隙结构为细胞的黏附、生长提供了最佳的三维空间。不过，当前得到应用的天然材料也有其缺点，如胶原获取困难，机械强度范围较窄，诱导细胞分化能力单一而且不足等等。因此，寻找一款既廉价易得，还具有促进细胞黏附与生长能力，同时又来自于天然产物的材料，是当前组织工程学的热点方向。
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)由多种复杂的成份构成，包括各型胶原、可溶性细胞因子、化学介质、蛋白多糖、糖蛋白、肽类、脂肪酸和各种小分子物质等。ECM可影响细胞的分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程[崔云华，“国外医学分子生物学分册”，第24卷第1期，第47-49页(2002)]。作为生物界重要组成成份的各种多糖(polysaccharides)，既是细胞外基质的成分之一，也被认为可以与细胞外基质发生密切作用，如促进胶原蛋白分泌，诱导细胞因子表达等等。正基于此，国内外大量实验已经证明，来自于动植物的各种多糖物质，的确具有促进多种细胞分化与增殖的作用。此外，不同分子量大小和残基修饰的多糖，还具有调节免疫，降低血脂，抗癌，抗病毒等多方面功效[Hurtley，S等人，“Science”，第291卷，第2337-2343页(2001)]。
然而，尽管多糖物质拥有极佳的生物相容性和综合多样的生物效应，但由于其存在着较强的亲水性及较难的可塑性的缺点，至今没有被广泛地运用于组织工程和其他的生物材料领域。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术存在的缺陷，研制一种从天然药物白芨中提取多糖材料及制备方法。
本发明的技术方案是一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料，其主要技术特征在于从天然药物白芨块茎中提取得到多糖材料。
本发明的另一技术方案是一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其主要技术特征在于步骤如下(1)取天然药物白芨块茎进行多糖组份初步提取，再经小分子脂溶性物质去除蛋白，再经离子交换层析、凝胶过滤层析，得纯品提取物白芨多糖材料，呈固体粉末状；(2)将白芨多糖提取物经下述方法处理(2-1)将固体粉末状多糖材料灭菌处理；或(2-2)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，灭菌处理；或(2-3)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，在细胞培养皿表面铺成均匀薄层，风干后经化学处理后交联，得不溶于水的膜状材料，灭菌处理。
本发明的优点和效果在于从天然药物白芨中分离、提取得到的白芨多糖作为一种多糖，能与细胞外基质成分作用，促进细胞黏附与贴壁生长；同时，白芨多糖作为天然药物成分，其交联所得的膜，成型良好，具有很强的韧性，良好的生物相容性和可降解性，是组织工程材料的良好选择。
本发明所采取的浓度范围在在每10毫升水，磷酸缓冲液，无机盐溶液或其他有机溶液中，含天然药物白芨的多糖提取物100-300毫克。
本发明采用了多种贴壁生长的细胞，实验证明(1)对于鼠肺成纤维L929细胞，人肝L-02细胞，鼠单核巨噬细胞Raw264.7，人胚胎肾细胞293T，人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，人骨髓基质干细胞hMSC等数种细胞，白芨多糖材料可以明显促进它们的黏附与生长速度；(2)对于人肝癌HepG2细胞，白芨多糖材料可以促进它的黏附速度，但不能诱导其增殖；(3)对于非洲绿猴肾COS-7细胞与人宫颈癌细胞HeLa，白芨多糖材料不具有促进它黏附生长的作用。
本发明通过对天然药物白芨块茎提取多糖成分，经处理得到了白芨多糖材料。它具有促进多种细胞黏附生长的作用，并具有极好的生物相容性和可降解性，是一款具有良好应用前景的生物材料。
图1——为白芨多糖半纯品经凝胶过滤层析得单一洗脱糖峰。
图2——为白芨多糖纯品红外光谱图。
图3——为白芨多糖交联成膜后，试铺L929成纤维细胞，于0.5小时拍摄照片图。
图4——为白芨多糖膜上L929成纤维细胞黏附生长趋势图。
图5——为白芨多糖膜上非洲绿猴肾COS-7细胞黏附生长趋势图。
图6——为白芨多糖膜上人肝L-02细胞黏附生长趋势图。
图7——为白芨多糖膜上人肝癌HepG2细胞黏附生长趋势图。
图8——为白芨多糖膜上鼠单核巨噬细胞Raw264.7黏附生长趋势图。
图9——为白芨多糖水溶液作用下人宫颈癌细胞HeLa黏附生长趋势图。
图10——为白芨多糖水溶液作用下人胚胎肾细胞293T黏附生长趋势图。
图11——为对照组人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长形态照片图。
图12——为白芨多糖水溶液作用下人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长形态照片图。
图13——为白芨多糖水溶液作用下人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长趋势图。
图14——为白芨多糖膜上人骨髓基质干细胞hMSC黏附生长趋势图。
具体实施例方式
第一步白芨多糖纯品的提取及溶液配制取市售中药兰科植物白芨块茎，充分碾碎后水煮3小时，沸腾8-10次，三层纱布过滤取滤液，加入两倍体积无水乙醇，沉淀过夜；离心弃去上清，反复三次后取沉淀抽滤，溶于双蒸水，Sevag法沉淀蛋白杂质，反复多次至考马斯亮蓝法检测无蛋白；无水乙醚萃取，取水相冻干得白芨多糖粗品；粗品经DE-52离子交换柱(Whatman产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖半纯品；半纯品经Sephadex G-200凝胶过滤柱(Pharmacia产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰，见图1。冻干得白芨多糖纯品，红外光谱检测多糖组成为葡萄糖与甘露糖，见图2。
将20毫克多糖纯品的固体粉末溶解于1毫升双蒸水，形成具有黏度的溶液，滤膜过滤除菌备用。
第二步白芨多糖膜的制备(一)按照第一步所述方法配制白芨多糖纯品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔细胞培养皿并敞放于超净工作台中，待其完全风干后取出。接着进行60Co-γ射线照射20分钟，即得不溶于水的膜状材料，灭菌后备用。
膜形态观察肉眼观察质地均一，透光性佳，基本呈透明状；光学显微镜观察表面有微粒状纹路；水溶性观察在三块膜上分别滴加500微升蒸馏水，0.5摩尔/升醋酸溶液，RPMI-1640细胞培养液，放置72小时，未见膜形态变化；试铺L929成纤维细胞(培养方法和接种方法见后面第四步)观察，细胞分散良好，见图3。
或者采用第三步白芨多糖膜的制备(二)按照第一步所述方法配制白芨多糖纯品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔细胞培养皿并敞放于超净工作台中，待其完全风干后取出。接着进行强紫外光照射60分钟，即得不溶于水的膜状材料，灭菌后备用。
按照第二步所述方法进行膜形态观察与检验。
第四步白芨多糖膜培养细胞实验(一)按照第二步所述方法制备白芨多糖膜。
鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为3×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤如下在各时间段，吸出各孔培液，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻柔冲洗两遍，弃去，加入100微升事先配制好的MTT液(Sigma产品，浓度5毫克/毫升，溶剂为PBS)及400微升细胞培液，细胞培养箱中孵育5小时，取出吸去各孔反应液，再次用PBS轻柔冲洗两遍，加入500微升二甲亚砜(DMSO，Sigma产品)反应半小时后，转移至酶标板(Costar产品)，酶联检测仪(BioRad产品)于575纳米读数。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上L929细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图4。
或者采用第五步白芨多糖膜培养细胞实验(二)按照第二步所述方法制备白芨多糖膜。
SV40转化的非洲绿猴肾COS-7细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液(Gibco产品)中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为3×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上COS-7细胞黏附速度不及空白对照组；MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量不及空白对照组，见图5。
或者采用第六步白芨多糖膜培养细胞实验(三)按照第二步所述方法制备白芨多糖膜。
人肝L-02细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为5×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上L-02细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图6。
或者采用第七步白芨多糖膜培养细胞实验(四)按照第三步所述方法制备白芨多糖膜。
人肝癌HepG2细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为5×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上HepG2细胞黏附速度比空白对照组快；然而，MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量与空白对照相似，见图7。
或者采用第八步白芨多糖膜培养细胞实验(五)按照第三步所述方法制备白芨多糖膜。
鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上Raw264.7细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图8。
或者采用第九步白芨多糖膜培养细胞实验(六)按照第一步所述方法制备白芨多糖水溶液。
人宫颈癌细胞HeLa购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于预设样品孔与空白对照孔。预设样品孔在接种细胞后滴加白芨多糖水溶液，保证白芨多糖浓度在80微克/毫升。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，添加白芨多糖组HeLa细胞黏附速度不及空白对照组；MTT实验结果证明24小时，添加白芨多糖组贴壁生长的细胞数量不及空白对照组，见图9。
或者采用第十步白芨多糖膜培养细胞实验(七)按照第一步所述方法制备白芨多糖水溶液。
人胚胎肾细胞293T购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于预设样品孔与空白对照孔。预设样品孔在接种细胞后滴加白芨多糖水溶液，保证白芨多糖浓度在80微克/毫升。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，添加白芨多糖组293T细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，添加白芨多糖组贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图10。
或者采用第十一步白芨多糖膜培养细胞实验(八)按照第一步所述方法制备白芨多糖水溶液。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于预设样品孔与空白对照孔。预设样品孔在接种细胞后滴加白芨多糖水溶液，保证白芨多糖浓度在80微克/毫升。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，添加白芨多糖组HUVEC细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，添加白芨多糖组贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图11、图12和图13。
或者采用第十二步白芨多糖膜培养细胞实验(九)按照第二步所述方法制备白芨多糖膜。
人骨髓基质干细胞hMSC从正常人骨髓血中分离，具体方法为抽取骨髓血约5毫升，注入含肝素培养液中，加入等量PBS中，1500转/分离心5分钟，洗涤2-3次，再以PBS重新混悬细胞。用PBS配制25％-60％的percoll(Amersham产品)密度梯度溶液，再将混匀的骨髓细胞小心加在其上，4℃下15000转/分离心20分钟，吸取中间分带清楚的单个核细胞层，以PBS稀释洗涤3次，最终保存于含10％胎牛血清，0.5％成纤维生长因子(FGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。以胰蛋白酶和EDTA消化传代，至得到较纯骨髓基质干细胞。
再取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为1×105个/毫升，0.5毫升每孔接种于样品(白芨多糖膜)孔与空白对照孔。在1.5小时，4小时和24小时用光学显微镜观察细胞生长状态；并用MTT法检测贴壁细胞数量，具体操作步骤同第四步。
形态观察结果证明，白芨多糖膜上hMSC细胞黏附速度比空白对照组快；MTT实验结果证明24小时，白芨多糖膜上贴壁生长的细胞数量多于空白对照，见图14。
本发明的保护范围并不仅局限于本实施例的描述。
权利要求
1.一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料，其特征在于从天然药物白芨块茎中提取得到多糖材料。
2.一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤如下(1)取天然药物白芨块茎进行多糖组份初步提取，再经小分子脂溶性物质去除蛋白，再经离子交换层析、凝胶过滤层析，得纯品提取物白芨多糖材料，呈固体粉末状；(2)将白芨多糖提取物经下述方法处理(2-1)将固体粉末状多糖材料灭菌处理；或(2-2)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，灭菌处理；或(2-3)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，在细胞培养皿表面铺成均匀薄层，风干后经化学处理后交联，得不溶于水的膜状材料，灭菌处理。
3.根据权利要求2所述的一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤(1)将白芨块茎碾碎后水煮至沸腾，过滤取滤液，加入无水乙醇沉淀，离心弃去上清，取沉淀抽滤，溶于双蒸水，Sevag法沉淀蛋白杂质，无水乙醚萃取，水相冻干得白芨多糖粗品，将粗品经DE-52离子交换柱层析，蒽酮-硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖半成品，半成品经Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，蒽酮-硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖纯品。
4.根据权利要求2所述的一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤(2-3)的化学处理步骤(1)强紫外线照射待细胞培养皿中的多糖材料溶液薄层完全风干后置放于紫外交联仪下照射；或(2)60Co-γ射线照射待细胞培养皿中的多糖材料溶液薄层完全风干后进行60Co-γ射线照射。
5.根据权利要求2所述的一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤(2-1)、(2-2)、(2-3)可组合应用。
6.根据权利要求4所述的一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤(1)、(2)可组合应用。
7.根据权利要求4所述的一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其特征在于步骤(2-2)、(2-3)所使用的溶剂包括水、磷酸缓冲液、无机盐溶剂、有机溶剂的一种。
全文摘要
本发明涉及一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的提取及制备方法。本发明取天然药物白芨块茎进行多糖组份初步提取，经小分子脂溶性物质去除蛋白，再经离子交换层析、凝胶过滤层析，得纯品提取物白芨多糖材料，呈固体粉末状，再灭菌处理等。本发明从天然药物白芨中分离、提取得到的白芨多糖作为一种多糖，能与细胞外基质成分作用，促进细胞黏附与贴壁生长；同时，白芨多糖作为天然药物成分，其交联所得的膜，成型良好，具有很强的韧性，良好的生物相容性和可降解性，是组织工程材料的良好选择。解决了现有技术无法克服的多糖物质具有较强的亲水性及较难的可塑性的缺陷。本发明制备方法简单，易于控制，费用低。
文档编号C08B37/00GK1709915SQ20051004066
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者孙剑涛, 张峻峰, 王春明, 刁华佳 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院