专利名称：一种海绵细胞的微载体三维培养方法
技术领域：
本发明涉及海洋无脊椎动物细胞的培养，具体地说是一种海绵细胞的微载体三维培养方法。
背景技术：
海绵是最低等的海洋无脊椎动物，属多孔动物门(Porifera)，营滤食、固着生长。已经发现海绵的次生代谢产物具有抗炎、抗肿瘤、抗HIV等生物活性。采用现代生物技术在体外生产这些活性物质是目前国际上倍受关注的问题(文献1.Belarbi EH，Gómez AC，Chisti Y.Camacho FG，Grima EM.Producing drugs from marine sponges，Biotechnology Advances，21(7)，585-598，2003)。海绵天然产物开发药物的研究遇到的瓶颈问题是药源的供给不足。解决途径包括海水养殖、有机合成、细胞培养等。Custodio等(文献2.Custodio MR，Prokic I，Steffen R，Koziol C，Borojevic，Brümmer F，NickelM，Müller WEG.Primmorphs generated from dissociated cells of the spongeSuberites domunculaa model system for studies of cell proliferation and celldeath，Mechanisms of Ageing and Development，105(1-2)，45-59，1998)的研究表明，通过细胞-细胞粘附形成聚集体——细胞团，可以恢复海绵细胞的端粒酶活性，使细胞具有增殖潜力。一些学者对不同的海绵形成细胞团做了进一步的研究，目前被认为是最有前途的海绵细胞离体培养方法之一。张卫等(文献3.Wei Zhang，Xiaoying Zhang，Xupeng Cao，Junyi Xu，QuanyuZhao，Xingju Yu，Meifang Jin，Maicun Deng.Optimizing the formation of Invitro sponge primmorph from Chinese sponge Stylotella agminata(Ridley).J.Biotechnol.100161-168，2003)对中国南海撅突针(Stylotella agminataRidley)海绵的细胞团培养也做了较深入的研究。
微载体技术广泛应用于动物细胞的大规模离体培养，已开发的微载体包括实心和多孔微载体两类，可以适应不同类型细胞的贴附和高密度培养。微载体的材料较多，改性葡聚糖、玻璃、胶原等。其中，Cytodex系列微载体和玻璃微载体应用较广。Hillex是Solohill公司开发的新型微载体，可以适用于动物细胞在无血清及无蛋白培养基中的生长。这些微载体都是为陆地哺乳动物和昆虫等细胞的高密度培养开发的，对海洋无脊椎动物细胞是否适用还有待研究。Mcmahon(文献4.Mcmahon P.System for the cell cultureand cryopreservation of marine invertebrates.US 6054317，2000)将聚苯乙烯系列微载体用于海绵细胞的离体培养，还使用了腹足动物的血清。离散细胞易脱落；人工海水配方，细胞主要以细胞团形式存在；腹足动物血清获得困难，价格昂贵，不适用于大规模生产，但该工作为海绵细胞的离体培养提供了新的思路。细胞在微载体表面的贴附是应用微载体技术的关键步骤。Zhao(文献5.Zhao QY，Jin MF Müller WEG，Zhang W，Yu XJ，Deng MC.Attachment of Marine Sponge Cells of Hymeniacidon perleve on Microcarriers，Biotechnology progress，19(5)，1569-1573，2003)等考察了中国黄海繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)离散细胞在Cytodex 3，玻璃微载体和Hillex三种微载体上的贴附性质及不同接种条件对贴附的影响。该研究的重点是通过离散细胞与微载体的作用，选择合适的微载体材料。结果表明，中国黄海繁茂膜海绵细胞在玻璃微载体表面的贴附明显强于Cytodex 3和Hillex。海绵细胞长期培养中的一个关键是培养基，包括渗透压等物理条件和营养条件。培养基为细胞的生长和代谢提供养分和适合的环境条件，是海绵细胞离体培养的研究重点之一。目前开发的培养基主要是哺乳动物和昆虫细胞系的，迄今为止，有关海绵细胞培养基的研究还很少，针对不同种属海绵开发针对性的培养基是非常重要的。Willoughby(文献6.Willoughby R，Pomponi SA.Quantitative Assessment of Marine Sponge Cells in VitroDevelopment Of Improved Growth Medium.In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal36194-200，2000) 研究了Teichaxinella morchella海绵(Porifera，Demospongiae，Axinellida，Axinellidae)培养基中谷氨酰胺、硒和小牛血清的影响。Zhang XY等(文献7.Zhang XY，Pennec GL，Steffen R，Müller WEG，Zhang W.Application of a MTT Assay for Screening Nutritional Factors inGrowth Media of Primary Sponge Cell Culture.Biotechnology progress，20(1)，151-155，2004)考察了几个营养因素(SiO32-、Fe3+、谷氨酰胺、丙酮酸等)对寄居蟹皮海绵Suberites domuncula生长的影响。Muller WEG.提出海绵细胞的细胞团培养技术(文献8.Muller WEG.Production of primmorphs fromdissociated cells of sponges and coral.US 6664106B1)；但其未给出优化培养基配方。另外，不同种属的海绵有不同的营养需要，开发通用和专用培养基是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海绵细胞团在微载体表面贴附和培养的海绵细胞微载体三维培养方法，为海绵细胞的离体培养提供一种可行的新技术；在一定的条件下，将细胞团牢固的贴附在微载体表面，更有利于保持海绵细胞的端粒酶活性和增殖性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为微载体的选取微载体可以选择玻璃微载体、Cytodex 3等实心微载体，也可以选择ImmobaSil系列、Cytoline系列多孔微载体、明胶、明胶+聚赖氨酸或明胶+壳聚糖等复合材料制备的实心或多孔微载体。实心微载体的接种条件为5～20g/L(培养液)，多孔微载体的接种条件为2～10g/L(培养液)。
海绵在改进人工海水中的培养海水组成包括Na+300～500mM，SO42-7.0mM，HCO3-0.2mM，K+10.0mM，Tris HCl 20.0mM，Cl-300～500mM，Mg2+50mM，Ca2+10.0mM，SiO32-5～150μM，Fe3+30～120μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-30～120μM，pH7.6～8.2。PHA的添加浓度为1.5～2.5％。
在培养5～8天后，添加碳源(葡萄糖、山梨醇或丙酮酸钠)、氮源(包括甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和维生素C的浓度5～20μM，之后每隔2～3天更换培养液体积的50～80％，用改进的人工海水替换并添加碳源和氮源使其最终浓度达到20～50μM，在此条件下海绵细胞能进行正常生长。
培养基的添加成分还可能包括0.01～10.0％的DMEM或RPMI1640，5～15μg/L的刀豆蛋白(ConA)。
适合的海绵细胞接种范围为1×106～9×107cells/ml。
本发明具有如下优点1.可大规模生产药源。本发明提出细胞团的微载体培养，细胞聚集体贴壁牢固，在保证海绵端粒酶活性的同时，为海绵细胞增殖提供贴附表面，有利于海绵细胞的大规模培养。
2.可选材料更广泛。本发明培养基优化后，细胞贴壁能力增强，细胞形成聚集体后以贴附于微载体表面的形式存在，海绵细胞培养的可选择微载体范围扩大；可用于海绵细胞培养的微载体除实心微载体外，还包括多孔微载体(商用微载体玻璃等实心微载体，以及ImmobaSil系列和Cytoline系列多孔微载体)；材料扩大到有机硅材料、明胶及其改性复合材料。
3.本发明提出了海绵细胞团的微载体培养技术；是以海绵细胞的聚集体形式进行微载体培养；提出了适合微载体培养的优化培养基；培养基中包括锌等元素，以及促生长因子以及抑制分裂剂；并采用营养成分的逐步添加的方法控制污染。
4.应用前景好。本发明属海洋无脊椎动物细胞培养领域，可实现海绵细胞的大规模培养来生产海绵次生代谢产物，为海洋药物的开发提供药源生产技术。
图1为繁茂膜海绵细胞在Glass Beads上的贴附过程的光镜照片(×100；接种A0h；B2h；C12h；D25h)；图2为繁茂膜海绵细胞在改进人工海水中的培养的光镜照片(A×40；B×400)；图3为繁茂膜海绵的人工海水培养的光镜照片(×250)；图4为繁茂膜海绵细胞的ImmobaSil FS培养SEM照片；图5为繁茂膜海绵细胞的ImmobaSil FS培养光镜照片(×400)。
具体实施例方式
实施例11)繁茂膜海绵1×107cells/ml，培养体积4ml，18～22℃，海绵细胞在改进的人工海水中的培养海水组成包括Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0085g/L，FeC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl 20.0g/L，ZnCl20.00054g/L，MgCl2·6H2O10.165g/L，CaCl21.1099g/L。PHA的添加浓度为2.5％。选取玻璃微载体，接种条件15g/L(改进人工海水)。
2)在培养7天后，添加葡萄糖15μM、甘氨酸10μM、天冬酰胺10μM和谷氨酰胺10μM、维生素C 10μM，之后每隔2～3天更换培养液体积的50～80％，用改进的人工海水替换并添加碳源和氮源使其最终浓度达到50μM，维生素C的浓度在20μM，在此条件下海绵细胞能进行正常生长。同时培养液中添加80U庆大霉素，控制微生物污染的发生。
参见图1所示，观察繁茂膜海绵细胞的玻璃微载体培养过程，游离细胞很快贴附在微载体上；部分游离细胞脱落，部分细胞在培养液中形成细胞聚集体；细胞聚集体会贴附在微载体上，同时空球率增加。这与细胞团的形成过程略有不同。游离细胞在玻璃微载体上贴附最好，由多个细胞聚集体和微载体形成的更大的聚集体也是在玻璃微载体中出现的最快。海绵细胞细胞团更牢固的贴附在微载体表面，甚至形成粘附和细胞的拓展。
实施例2繁茂膜海绵1×107cells/ml，培养体积4ml，18～22℃，海绵细胞在改进的人工海水(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0085g/L，FeC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl20.0g/L，ZnCl20.00054g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)以及2.5％PHA中培养，海绵细胞团贴在培养孔板底部，在对照培养基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.418g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl31.5591g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)中，细胞以聚集体的形式存在但不贴壁(参见图2、3所示)。
实施例3繁茂膜海绵细胞3.0～8.0×106cells/ml，并以3g/L ImmobaSil FS多孔微载体接种。在多孔微载体内，离散细胞和细胞聚集体都可以贴附在微载体(参见图2、3所示)。细胞的人工海水组成为Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218 g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl 31.5591g/L，MgCl2·6H2O10.165g/L，CaCl21.1099g/L。
实施例4在96孔板(聚苯乙烯材质)中，分别加入50μl繁茂膜海绵提取液、肾指海绵提取液、1％壳聚糖溶液、0.2％明胶溶液、0.9％琼脂，4℃保存48h后，取出制膜液，CMFSW清洗海绵提取液膜和明胶膜；在壳聚糖膜中加1％NaOH作用10h，CMFSW清洗数次。96孔板冰箱4℃保存。使用前，紫外照射。经过不连续Ficoll密度梯度富集海绵原细胞。在静止的环境中，细胞的迁移形成细胞聚集体。不同的有机基质会影响细胞的运动，进而影响细胞-细胞粘附。繁茂膜海绵细胞可以在繁茂膜海绵提取物、明胶上发生贴附并拓展。琼脂可以促进海绵细胞聚集，但不促进贴附。
实施例5繁茂膜海绵约1×107cells/ml，18～22℃培养，海绵细胞在改进的培养基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0041g/L，FeC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl 23.0g/L，ZnCl20.000032g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L，PHA 1.5％，选取Cytodex 3微载体，接种条件5g/L(改进人工海水)。
在培养5天后，添加0.1％(v/v)DMEM，葡萄糖0.0040g/L、谷氨酰胺0.0029g/L、天冬酰胺0.0027g/L、甘氨酸0.0015g/L和维生素C 0.0035g/L)中培养，生物量(MTT法检测)比对照培养基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl 31.5591g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)高40％；之后每隔2～3天更换培养液体积的50％，用改进的人工海水替换并添加碳源和氮源使其最终浓度达到40μM，维生素C的浓度在10μM，在此条件下海绵细胞能进行正常生长。同时培养液中添加100U庆大霉素，控制微生物污染的发生。营养成分分步加入并不断更新培养液，可以有效控制微生物污染的发生。
实施例6与实施例5不同之处在于，在改进人工海水的水溶液中同时使用1.5％PHA和5μg/L刀豆蛋白(ConA)，生物量比实施例5改进培养液高5～10％。
实施例7与实施例1不同之处在于，选取明胶+壳聚糖复合材料制备的多孔微载体，接种条件8g/L(改进人工海水)，海绵细胞能进行正常生长。
明胶+壳聚糖复合材料制备的多孔微载体的制备参照文献Li KG，WangY，Miao ZC，Xu DY，Tang YF，Feng MF.Chitosan/gelatin compositemicrocarrier for hepatocyte culture.Biotechnology Letters，26879-883，2004。
权利要求
1.一种海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于1)在改进人工海水中接种微载体和海绵细胞进行培养；改进人工海水的水溶液中包括Na+300～500mM，SO42-5.0～10.0mM，HCO3-0.1～0.5mM，K+5.0～15.0mM，Tris HCl 10.0～30.0mM，Cl-300～500mM，Mg2+20～60mM，Ca2+5.0～20mM，SiO32-5～150μM，Fe3+30～120μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-30～120μM，pH7.6～8.2，PHA的重量浓度为1.5～2.5％；2)在海绵细胞培养5～8天后，向上述改进人工海水中添加有机碳源、有机氮源和维生素C，使它们的浓度分别为5～20μM，形成新的培养液体系；3)在步骤2)之后，每隔2～3天更换培养液体积的50～80％，用改进的人工海水替换并添加有机碳源和氮源使其最终浓度达到20～50μM，添加维生素C使其最终浓度达到10～20μM，在此条件下海绵细胞能进行正常生长。
2.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于所述有机碳源为葡萄糖、山梨醇和/或丙酮酸钠；有机氮源为甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺。
3.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于所述微载体可以选择实心微载体或多孔微载体，实心微载体的接种条件为每升改进人工海水5～20g，多孔微载体的接种条件为每升改进人工海水2～10g。
4.按照权利要求3所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于所述实心微载体为玻璃微载体、Cytodex 3，明胶、明胶+聚赖氨酸或明胶+壳聚糖复合材料制备的实心微载体；多孔微载体为ImmobaSil系列、Cytoline系列多孔微载体，明胶、明胶+聚赖氨酸或明胶+壳聚糖复合材料制备的多孔微载体。
5.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于所述海绵细胞接种范围为1×106～9×107cells/ml。
6.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于在所述有机碳源和氮源添加的同时还可添加DMEM或RPMI1640，使其在培养液中的体积浓度为0.01～10.0％。
7.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于在所述改进人工海水的水溶液中还可添加刀豆蛋白，其添加量为每升培养液5～15μg/L。
8.按照权利要求1所述海绵细胞的微载体三维培养方法，其特征在于所述改进人工海水的水溶液中包括Na+350～400mM，SO42-7.0mM，HCO3-0.2mM，K+10.0mM，Tris HCl 20.0mM，Cl-350～400mM，Mg2+50mM，Ca2+10.0mM，SiO32-5～150μM，Fe3+40～80μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-40～50μM，pH7.6～8.2，PHA的重量浓度为1.5～2.5％。
全文摘要
本发明涉及海洋无脊椎动物细胞的培养，具体地说是一种海绵细胞的微载体三维培养方法；1)在改进人工海水中接种微载体和海绵细胞进行培养；改进人工海水的水溶液中包括Na
文档编号C12N5/06GK1706937SQ200410020708
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月9日 优先权日2004年6月9日
发明者张卫, 赵权宇, 虞星炬, 金美芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所