专利名称：一种海绵原细胞的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及海绵原细胞(干细胞)的分离纯化，具体地说是一种分离纯化海绵原细胞的方法，提高了从混合海绵细胞中分离原细胞的纯度和效率。
背景技术：
海绵组织中可分离提取出大量的结构新颖、活性极强的具有抗肿瘤、抗感染、抗HIV的活性物质，为获得上述活性产物、以海绵细胞体外培养为基础的海绵细胞工程研究也日渐引起关注，并成为解决海绵活性物质供给不足这一瓶颈问题的最有希望的途径之一。海绵，多孔动物门，是一类低等海洋多细胞动物，靠过滤海水为食，有丰富的水沟系统，尤其是一些体态较小潮间带海绵，例如繁茂膜海绵，这种特殊的多孔性结构导致在体外培养过程中无法进行定位取材，因此，在进行原代培养时，一般都是将海绵组织整体进行充分离散，分离出全部海绵细胞，直接培养或经初步分离后再培养。
海绵组织一般由原细胞(archaeocyte)、胶原细胞(collencyte，lophocyte，mucoid cell)、造骨细胞(sclerocyte)、扁平上皮细胞(pinacocyte)、领细胞(choanocyte)、肌细胞(myocyte)、孔细胞(porocyte)、灰细胞(gray cell，glycocyte)、小球细胞(spherulous cell)、泡细胞(cystencyte)、细菌性细胞(bacteriocyte)等多种细胞构成，其中原细胞是海绵组织中的多能干细胞，具有较强的增殖能力，并且能够分化成为胶原细胞、造骨细胞、上皮细胞、肌细胞、领细胞这些构成海绵体的主要细胞类型。
对于海绵细胞体外培养这一挑战性的课题，体外培养对象，即细胞种类的选择，对体外培养相关研究有重要影响，而某一类型海绵细胞培养的前提工作就是该类细胞的分离纯化。但由于对海绵细胞膜表面抗原，尤其是细胞种类特异性膜蛋白的研究很少，加之不同海域、不同种属海绵差异性较大，目前还没有明确的海绵细胞分类的特异性标记物。因此，国内外的海绵细胞培养工作，大多利用混合海绵细胞培养，即使所使用的细胞分离方法也多为密度梯度离心方法，都未能对某类细胞进行高度富集。
发明内容
本发明的在于提供一种分离纯化海绵的干细胞——原细胞的方法。通过四步分离方法偶联使用，实现了海绵中原细胞的有效分离和高度纯化。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为本发明根据各类海绵细胞的不同生物学特性，将差速离心、细胞特异性聚集、差速黏附和密度梯度离心四步分离方法偶联使用，以较高的纯度和效率分离纯化出海绵原细胞；实现将海绵原细胞以较高的纯度从由10多种细胞构成的混合海绵细胞中分离出来；可按如下步骤操作(1)海绵细胞离散-混合海绵细胞的制备取新鲜洁净的健康海绵组织块，切割成1-10mm3小块，振荡离散出海绵细胞，用200～500目筛网(如尼龙网、不锈钢、铜网)过滤，离心，留细胞沉淀(弃上清，)用含EDTA的CMFSW(无钙镁海水)重悬即为混合海绵细胞；具体为取新鲜或经水族槽暂养1-2周的健康海绵组织块，用含200-800ug/ml庆大霉素的无钙镁海水洗涤(3-5次)，洗去除表面微生物及其他共生物后，剔除夹杂于组织块中的藻类和泥沙等杂质；再将组织块切割成1-3mm3小块，4℃保存，浸泡于CMFSW中，洗涤3-5遍，每次2-3小时，振荡30min离散出海绵细胞，重复两次，过滤，离心，1000-3000rpm，10min；用含1-2mM EDTA的CMFSW重悬细胞沉淀即为混合海绵细胞；特点为混合海绵细胞的制备过程不使用EDTA，而用含抗生素的CMFSW多次洗涤海绵组织块，使海绵组织呈“骨质疏松”样，使海绵细胞易于离散，这样不但可以最大限度地减少高浓度EDTA(10-20Mm)介导的化学离散过程对海绵细胞的化学性损伤，利于各类海绵细胞更好地保持其各自的细胞学特征，还有利于清除海绵组织的水沟系及细胞间质中的微生物；制备得混合细胞后，为了防止海绵细胞聚集，使海绵细胞处于离散状态，用含1-2mM EDTA的CMFSW制备细胞悬液，以方便下面的分离过程。
(2)差速离心将混合海绵细胞悬液进行低速离心，300～800rpm，10～30min，(差速离心条件通常为300～600rpm，10～20min)留取细胞沉淀，弃去上清；离心后所得细胞沉淀主要为原细胞、胶原细胞等大体积海绵细胞和部分小体积海绵细胞，上清主要是领细胞、上皮细胞、孔细胞、灰细胞等小体积海绵细胞；(3)差速聚集(选择性聚集)将差速离心获得的细胞接种于CMFSW中，利用原细胞较其他细胞具有更强的聚集能力，经过18～25℃下8-12小时的选择性聚集，大多数原细胞及胶原细胞和部分上皮细胞先聚集成体积较大的不规则细胞聚集体，弃去体系中未参与聚集的小细胞及低活力的细胞；特点为海绵细胞在CMFSW中聚集，这种聚集没有钙、镁离子的参与，是由聚集因子——聚集因子受体介导的细胞特异性聚集，而原细胞较其他种类海绵细胞具有更强的聚集能力，易于成团；大部分原细胞都参与形成细胞聚集体，但细胞聚集体中还参有胶原细胞、上皮细胞等贴壁型细胞，未参与聚集的游离细胞主要为小体积细胞和活力低下细胞。
(4)差速黏附将细胞聚集体于人工海水(ASW)中进行培养，细胞聚集体贴壁，海绵细胞聚集体贴壁铺展达最大程度(即细胞达70-80％汇合)后，原细胞以聚集体或游离形式黏附在由贴壁的胶原细胞和上皮细胞构成的细胞基底层上，用CMFSW洗去ASW，利用原细胞和胶原细胞间黏附贴壁能力和方式的差异，镜下观测(镜下控制EDTA的作用时间，保证原细胞解离，而胶原细胞层仍保持贴壁状态，从而可以除去细胞聚集体中的胶原细胞和部分上皮细胞，一般作用时间为5-8min，由于胶原细胞在体积上与原细胞相差较小，且易与原细胞黏附聚集，所以此步骤是全部分离过程的限速步骤)应用含1～10mM(最好为2～5mM)EDTA的CMFSW先将原细胞离散下来，取出原细胞离散液，并震荡进行充分离散；取样计数其中的原细胞百分比并检测PCNA阳性率，再取样与BrdU共孵育考察BrdU阳性细胞百分比，其余细胞用于下一步分离；(5)密度梯度离心利用原细胞与其他细胞在体积和密度上的差异，再应用密度梯度离心法，进一步将原细胞和残存的胶原等细胞分离开，实现原细胞的最后纯化，密度梯度液的配制采取Ficoll和泛影葡胺联用，以降低Ficoll的粘度及其非特异性促细胞聚集作用，用2-5％的Ficoll(聚蔗糖)和20-40％泛影葡胺配制密度从1.01--1.10g/ml的梯度液(密度梯度液的密度分别为1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml)，并按照密度从高到低的顺序先后铺于试管中，将步骤(4)所得细胞悬液铺于梯度液上，500-2000rpm，离心10～30min，(最好为500-1500rpm，5～15min，)将各层细胞用滴管逐层取出，镜下观察，收集原细胞，用CMFSW洗去密度梯度介质，共洗涤2～4次。
各个分类步骤所使用的CMFSW和ASW都加入一定量的抗生素(庆大霉素，400ug/ml)，而且全部分离过程进行了多次细胞洗涤，最大限度地减少了海绵组织本身固有的微生物，因此降低了海细胞体外培养过程中污染的发生，至少延长了污染发生的时间，为获取更多的有效数据提供了更长的细胞体外操作时间。
本发明的优点如下1.分离效果好。本发明与常规利用密度梯度离心法富集海绵原细胞的不同之处在于，在进行密度梯度离心前，本发明通过采用差速离心、细胞特异性聚集、差速黏附法最大限度地纯化了原细胞，减少了其他种类海绵细胞对密度梯度离心的干扰，不但提高了分离所得原细胞的纯度(原细胞纯度大于90％)，还提高了原细胞的回收率(原细胞的回收率为50-60％)，而且分离后所得原细胞的活力在95％以上，实现了海绵原细胞的高效分离纯化，有利于下一步深入研究海绵干细胞生物学性质及其体外培养规律。
2.易于操作。本发明对于海绵干细胞的分离纯化，使用处理方法较为温和，充分利用各类海绵细胞自身生物学特性的差异，最后获得较高纯度和活力的海绵干细胞；该方法简便、稳定、易于操作、适于实验室常规使用，成本较低。还可以用于其他种类海绵细胞的分离纯化。
图1为差速离心前后海绵细胞构成及其BrdU和PCNA免疫组织化学染色光镜照片；其中(A)混合海绵细胞(×400).(B)混合海绵细胞BrdU免疫组织化学染色(×400).(C)混合海绵细胞PCNA免疫组织化学染色(×400).(D)500rpm，15min离心后海绵细胞(×400).(E)500rpm，15min离心后海绵细胞经BrdU免疫组织化学染色(×400).(F)500rpm，15min离心后海绵细胞PCNA免疫组织化学染色(×400)；图2为差速离心后，体积较大海绵细胞差速形成聚集体，并进行差速黏附贴壁的过程光镜照片；比较了差速聚集后及差速黏附黏附后所得海绵细胞的构成及其BrdU和PCNA免疫组织化学染色情况；其中(A)30min快聚集细胞形成细胞团(×40).(B)培养2小时，细胞团开始贴壁，胶原细胞开始向外迁移(×40).(C)培养4小时，胶原细胞继续迁移，细胞团开始铺展(×40).(D)培养6小时，细胞团继续铺展，并通过胶原细胞开始汇合(×250).(E)培养8小时，细胞团间达到最大融合(×40).(F)原细胞从胶原细胞上解离下来，胶原细胞仍处于贴壁状态(×400).(G)差速聚集的海绵细胞，混有部分胶原细胞和少量小细胞(×400).(H)差速聚集细胞的BrdU免疫组织化学染色(×400).(I)差速聚集细胞的PCNA免疫组织化学染色(×400).(J)差速黏附后，解离下来的细胞(×400).(J)差速黏附后，解离下来细胞的BrdU免疫组织化学染色(×400).(K)差速黏附后，解离下来海绵细胞的BrdU免疫组织化学染色(×400).(L)差速黏附后，解离下来海绵细胞的PCNA免疫组织化学染色(×400)；图3为(A)使用Ficoll泛影葡胺配制的密度梯度层示意图；(B)密度梯度离心后，海绵细胞在各个密度层的分布情况；图4为密度梯度离心后分离所得原细胞，及其BrdU和PCNA免疫组织化学染色情况；其中(A)密度梯度离心后，C5层的原细胞(×400).(B)原细胞中BrdU阳性细胞(×400)(C)原细胞PCNA阳性细胞(×400)；图5为混合海绵细胞经差速离心、差速聚集、差速黏附及密度梯度离心各个步骤所得海绵原细胞的百分比及其BrdU和PCNA百分比。其中MC混合细胞；DC差速离心；DA差速聚集；DAD差速黏附；DGC密度梯度离心；图6为原细胞与BrdU孵育时间对原细胞摄取BrdU的影响。
具体实施例方式
中国黄勃海繁茂膜海绵原细胞的分离纯化海绵细胞离散——混合海绵细胞的制备将2-3g新鲜采集或经水族槽暂养1-2周的健康繁茂膜海绵组织块，用含庆大霉素(400ug/ml)的无钙镁海水(CMFSW)洗涤3遍，以除去表面微生物及其他共生物后，切成1-3mm3小块，4℃保存，再用CMFSW洗涤3-5次，每次2-3小时，以160rpm的速度振荡离散出海绵细胞，300目尼龙滤网过滤，离心1500rpm，10min，用含2mM EDTA的CMFSW将细胞重悬，获得混合海绵细胞，用血细胞计数板计数混合细胞中原细胞的百分含量，留取样品考察PCNA阳性率，再将部分样品与BrdU共孵育，37℃，24小时，考察混合细胞中BrdU阳性细胞百分比，其余细胞用于下一步分离。见图1所示差速离心法——富集包括原细胞在内的大体积海绵细胞将上述利用1500rpm，10min离心制备的混合海绵细胞密度调整为2～5×107/ml，再以较小转速离心，500rpm，15min，弃去上清液，保留细胞沉淀，计数其中原细胞百分比，留取部分细胞与BrdU共孵育24小时，37℃，考察BrdU阳性细胞百分比，其余细胞用于下一步分离。见图1所示差速聚集法——富离聚集能力强的海绵细胞(以胶原细胞和原细胞为主的混合体)将500rpm，15min离心后的细胞沉淀物，用CMFSW洗涤两次以除去残存的EDTA，调整细胞密度为5～10×107/ml，于100ml玻璃培养瓶中于CMFSW中培养，10ml/瓶，20℃，8小时，振荡培养，20转/min，使原细胞充分参与聚集，形成细胞聚集体，弃去未参与聚集的游离海绵细胞，留取部分细胞样品计数细胞聚集体中的原细胞百分含量及PCNA和BrdU阳性率，其余细胞用于下一步分离。见图2所示差速黏附法初步分离原细胞——初步将胶原细胞和原细胞分离改用人工海水继续培养细胞聚集体，8-10小时，使之贴壁，待聚集体中的胶原细胞和上皮细胞充分贴壁分布于细胞聚集体底部，并进行活跃迁移、铺展达70-80％汇合时，停止培养，用CMFSW洗去ASW后，用含2mM EDTA的CMFSW将分布于细胞聚集体上层的原细胞离散下来，镜下控制EDTA作用的时间，防止作用时间过长使过多的胶原细胞脱壁，18-22℃下，处理时间为5min。将离散下来的原细胞用含2mM EDTA的CMFSW充分离散，取样计数其中的原细胞百分比并考察PCNA和BrdU阳性率，其余细胞用于下一步分离。见图2所示密度梯度离心纯化原细胞——进一步将原细胞与混杂的胶原细胞分开将上一步骤所得离散细胞，调节密度为5～10×107/ml，备用。
用CMFSW将Ficoll粉末配制成3％Ficoll(ρ＝1.0276g/ml，16℃)，并将76％的泛影葡胺原液稀释成为38％(ρ＝1.1486g/ml，16℃)，经过计算，配制密度为1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml的梯度液，用15ml试管时，每层梯度液为1ml，上样量为1-2ml，总细胞数量为2-5×107；用50ml试管时，则每层梯度液为5-10ml，上样量为3-5ml，总细胞数量为1-2×108，用水平离心机离心，1000rpm，20min。
待离心完毕，细胞分层后，用滴管将各层细胞取出，用CMFSW洗涤两次，去除密度梯度介质，镜下观察各层细胞形态，原细胞分布于密度为1.07和1.08两密度层之间，取样计数原细胞百分比并考察PCNA和BrdU阳性率，部分细胞用于细胞培养观察体外生长情况。见图3、4所示海绵原细胞增殖活力的检测方法(1)5-溴-2脱氧尿嘧啶(BrdU)标记及其免疫组织化学染色从上述各步骤所得海绵细胞中取样，计数其中的原细胞含量及细胞密度，按照106个细胞对应加入0.5ml BrdU(1∶1000)进行孵育，37℃，24小时，考察各步骤所得海绵细胞的BrdU阳性率。
对于最后经密度梯度离心获得的纯度较高的海绵原细胞，用BrdU摄取法来考察分离纯化各步骤所得细胞中处于DNA合成期细胞的百分含量，考察其与BrdU孵育时间为24，36，48，60小时的BrdU阳性率，以确定不同孵育时间对原细胞摄取BrdU的影响，发现随着孵育时间的延长，原细胞摄取BrdU的效率也增加。
BrdU阳性率的检测，按照Roche公司的BrdU标记和检测试剂盒说明书进行。海绵细胞经BrdU孵育后，用CMFSW洗涤三次，于1000rpm，离心5min，去除残余BrdU。调整细胞浓度为5×107/ml，取10ul细胞悬液涂于APES处理过的玻璃片上，70％乙醇(pH 2)固定30min，用PBS缓冲液洗涤三次，加抗BrdU抗体于细胞涂片上，37℃湿盒，孵育1小时，洗涤三次，加碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体，37℃湿盒，孵育1小时，洗涤三次，加新鲜配制的底物液(13ul NBT，10ul XP，3ml底物缓冲液，pH 9.6)，反应15min，PBS洗去底物液中止染色，梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树胶封片。镜检，计数BrdU阳性细胞数。参见图1、2、4所示方法(2)海绵细胞中增殖细胞核抗原(PNNA)的表达具体方法如下海绵细胞用CMFSW洗涤三次，调整细胞密度为5×107/ml，取10ul细胞悬液涂于APES处理过的玻璃片上，空气干燥后70％乙醇(pH2)固定30min，用PBS缓冲液洗涤三次，加抗PCNA抗体于细胞涂片上，37℃湿盒，孵育1小时，洗涤三次，加碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体，37℃湿盒，孵育1小时，洗涤三次，加新鲜配制的底物液(13ul NBT，10ul XP，3ml底物缓冲液，pH 9.6)，反应15min，洗去底物液中止染色，梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树胶封片。镜检，计数阳性细胞数。应用增殖细胞核抗原这一指标来考察海绵原细胞增殖能力，实验数据表明，随着分离过程的进行，所分离细胞中原细胞的比例逐渐增加，PCNA阳性细胞的比例也随之增加，说明所分离的细胞具有较强的增殖能力，从而证明所分离的细胞是海绵原细胞。参见图1、2、4所示。
权利要求
1.一种海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于可按如下步骤操作(1)混合海绵细胞的制备取新鲜洁净的健康海绵组织块，切割成1-10mm3小块，振荡离散出海绵细胞，用200～500目筛网过滤，离心，留细胞沉定用含EDTA的CMFSW重悬即为混合海绵细胞；(2)差速离心将混合海绵细胞悬液进行低速离心，300～800rpm，10～30min，留取细胞沉淀，弃去上清；(3)差速聚集将差速离心获得的细胞接种于CMFSW中，使海绵细胞自由聚集形成细胞聚集体，弃去未参与聚集的游离细胞；(4)差速黏附将细胞聚集体于人工海水中进行培养，细胞聚集体贴壁，海绵细胞聚集体贴壁铺展达最大程度后，用CMFSW洗去ASW，镜下观测应用含1～10mM EDTA的CMFSW先将原细胞离散下来，取出原细胞离散液，并震荡进行充分离散；(5)密度梯度离心配制密度梯度液，用2-5％的Ficoll和20-40％泛影葡胺配制密度从1.01-1.10g/ml的梯度液，将步骤(4)所得细胞悬液铺于梯度液上，于500-2000rpm，离心10～30min，将各层细胞用滴管逐层取出，镜下观察，收集原细胞。
2.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于所述步骤(1)过程中，取新鲜或经水族槽暂养1-2周的健康海绵组织块，用含200-800ug/ml庆大霉素的无钙镁海水洗涤，剔除杂质；再将组织块切割成1-3mm3小块，浸泡于CMFSW中洗涤，振荡离散出海绵细胞，过滤，离心，1000-3000rpm，10min；用含1-2mM EDTA的CMFSW制备细胞悬液。
3.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中所使用的差速离心条件为300～600rpm，10～20min。
4.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中海绵细胞在18～25℃下于CMFSW中培养8-12小时。
5.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于步骤(4)中用含2～5mMEDTA的CMFSW将原细胞解离下来。
6.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)中密度梯度液的密度分别为1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml；收集后的原细胞用CMFSW洗去密度梯度介质，500-1500rpm，5～15min，共洗涤2～4次。
7.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于考察海绵原细胞摄取BrdU效率与BrdU作用时间的关系，在具体实验中，跟踪各步骤分离效果时，所使用的BrdU的孵育条件为37℃，24小时。
8.按照权利要求1所述海绵原细胞的分离纯化方法，其特征还在于用抗增殖细胞核抗原抗体检测海绵细胞中增殖细胞核抗原的表达。
全文摘要
本发明涉及一种海绵干细胞——原细胞的分离纯化方法，通过差速离心、细胞特异性聚集、差速黏附和密度梯度离心四种方法联用，提高了海绵原细胞分离纯化的纯度和效率，为研究繁茂膜海绵干细胞的生物学特性及体外培养规律提供了一种有效的原细胞制备方法。
文档编号C12N5/07GK1814751SQ20051004585
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月5日 优先权日2005年2月5日
发明者张卫, 孙黎明, 虞星炬, 金美芳, 赵权宇 申请人:中国科学院大连化学物理研究所