一种嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种抗菌肽的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]目前在食品、医药和畜牧养殖行业，由于传统抗生素的大量使用及滥用，导致了大量耐药性菌株的出现及药物残留，对人类健康造成了极大的威胁。而且随着人们健康消费意识的提升，迫切需要开发不易产生耐药性且无残留、无安全隐患的新型天然抗菌物质。所以作为天然来源的蛋白类抗菌肽成为近年来研究的热点，并在食品、医药和畜牧养殖行业具有较广的应用。抗菌肽主要来源于昆虫、哺乳动物、两栖动物、植物、细菌等。
[0003]嗜酸乳杆菌是肠道的主要益生菌之一，属革兰氏阳性菌。它可以产生细菌素、有机酸、过氧化氢等多种天然抑菌物质。其产生的主要抑菌物质是细菌素，是一种多肽类抗菌物，具有广泛的用途。在食品工业中可以替代部分化学防腐剂，防止食品变质;在饲料工业上可以作为添加剂改善动物的肠道微生物类群；在医药工业上可以调节胃肠道菌群平衡，改善肠道微环境。嗜酸乳杆菌抗菌肽常规的提取方法是通过盐析法或有机溶剂沉淀法再经柱层析进行纯化，但是采用盐析法沉淀时会带有大量的杂蛋白，有机溶剂则会该使蛋白变性。而膜过滤是根据物质的分子量不同进行过滤，可以除去杂蛋白且不会影响蛋白的性质，同时该法适用于工业上大规模生产。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足之处，本发明解决的问题为:传统方法会使制备的嗜酸乳杆菌抗菌肽里混有杂蛋白或者使蛋白变性。
[0005]为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下:
一种嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，包括步骤如下:(1)嗜酸乳杆菌固体发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；(2)将嗜酸乳杆菌发酵产物溶于水后，取上清液分别经过多个不同规格的超滤膜，得到不同分子量的组分；(3)将各个组分的上清液冻干，测量各个组分的抑菌活性；(4)将抑菌活性最好的组分通过凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽；
[5]嗜酸乳杆菌抗菌肽热稳定性测试。
[0006]进一步，所述步骤(I)中的发酵温度为36°C?37°C，厌氧发酵，培养时间为47h?49h0
[0007]进一步，所述步骤(2)中的超滤膜包括陶瓷膜、10000 Da超滤膜和1000 Da超滤膜，得到四组不同分子量的组分。
[0008]进一步，所述步骤(3)中通过打孔法测抑菌活性。
[0009]进一步，所述步骤(3)中采用单层琼脂打孔法，以大肠杆菌k99和金黄色葡萄球菌作为指示菌，根据抑菌圈推断各个组分的抑菌活性。
[0010]进一步，所述步骤(4)中通过Sephadex G_50凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽。
[0011]进一步，所述的步骤(5 )中将嗜酸乳杆菌抗菌肽经过40 °C、70 °C、100 °C、121°C四个温度处理，测量各个温度阶段的嗜酸乳杆菌抗菌肽的抑菌活性变化。
[0012]本发明的有益效果
嗜酸乳杆菌抗菌肽常规的提取方法是通过盐析法或有机溶剂沉淀法再经柱层析进行纯化，但是采用盐析法沉淀时会带有大量的杂蛋白，有机溶剂则会该使蛋白变性。而本发明采用的超滤膜过滤是根据物质的分子量不同进行过滤，可以除去杂蛋白且不会影响蛋白的性质，同时该法适用于工业上大规模生产。
【具体实施方式】
[0013]下面对本
【发明内容】
作进一步详细说明。
[0014]—种嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，包括步骤如下:(I)嗜酸乳杆菌固体发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；(2)将嗜酸乳杆菌发酵产物溶于水后，取上清液分别经过多个不同规格的超滤膜，得到不同分子量的组分；(3)将各个组分的上清液冻干，测量各个组分的抑菌活性;(4)通过凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽；(5)嗜酸乳杆菌抗菌肽热稳定性测试。进一步优选，步骤(I)中的发酵温度为36°C?37°C，厌氧发酵，培养时间为47h?49h。进一步优选，所述步骤(2)中的超滤膜包括陶瓷膜、10000 Da超滤膜和1000 Da超滤膜，得到四组不同分子量的组分。进一步优选，所述步骤(3)中通过打孔法测抑菌活性。进一步优选，所述步骤(3)中采用单层琼脂打孔法，以大肠杆菌k99和金黄色葡萄球菌作为指示菌，根据抑菌圈推断各个组分的抑菌活性，根据抑菌圈推断分子量在1000?1000Da的组分为有效组分。进一步优选，所述步骤(4)中通过Sephadex G_50凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽。进一步优选，所述的步骤(5)中将嗜酸乳杆菌抗菌肽经过40°C、70°C、100°C、121°C四个温度处理，测量各个温度阶段的嗜酸乳杆菌抗菌肽的抑菌活性变化，经测试，嗜酸乳杆菌抗菌肽经过40 °C、70 °C、100 °C、121°C四个温度处理以后的抑菌活性表现的很稳定。
[0015]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，包括步骤如下:(I)嗜酸乳杆菌固体发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；(2)将嗜酸乳杆菌发酵产物溶于水后，取上清液分别经过多个不同规格的超滤膜，得到不同分子量的组分；(3)将各个组分的上清液冻干，测量各个组分的抑菌活性；(4)将抑菌活性最好的组分通过凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽;(5)嗜酸乳杆菌抗菌肽热稳定性测试。2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵温度为36°C?37°C，厌氧发酵，培养时间为47h?49h。3.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中的超滤膜包括陶瓷膜、10000Da超滤膜和1000 Da超滤膜，得到四组不同分子量的组分。4.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3 )中通过打孔法测抑菌活性。5.根据权利要求4所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用单层琼脂打孔法，以大肠杆菌k99和金黄色葡萄球菌作为指示菌，根据抑菌圈推断各个组分的抑菌活性。6.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中通过SephadexG_50凝胶柱层析，得到了高纯度的嗜酸乳杆菌抗菌肽。7.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，所述的步骤(5)中将嗜酸乳杆菌抗菌肽经过40°(:、70°(:、100°(:、121°(:四个温度处理，测量各个温度阶段的嗜酸乳杆菌抗菌肽的抑菌活性变化。
【专利摘要】本发明公开了一种嗜酸乳杆菌抗菌肽的分离纯化方法，包括步骤如下：（1）嗜酸乳杆菌固体发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；（2）将嗜酸乳杆菌发酵产物溶于水后，取上清液分别经过多个不同规格的超滤膜，得到不同分子量的组分；（3）将各个组分的上清液冻干，测量各个组分的抑菌活性；（4）将抑菌活性最好的组分通过凝胶柱层析；（5）嗜酸乳杆菌抗菌肽热稳定性测试。本发明采用的超滤膜过滤是根据物质的分子量不同进行过滤，可以除去杂蛋白且不会影响蛋白的性质，同时该法适用于工业上大规模生产。
【IPC分类】C07K7/08, C07K7/06, C07K14/335, C07K1/16, C07K1/34, C07K1/36
【公开号】CN105566453
【申请号】CN201610046476
【发明人】李世超, 方华, 季春源, 朱校适, 郭子好
【申请人】江苏盐城源耀生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月25日