专利名称：具免疫调节活性并促进细胞素生成的制剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及由植物和植物残渣获得无毒制剂的方法;所述制剂给人和动物使用时，具有免疫调节活性，并能促进细胞素(干扰素、肿瘤坏死因子等)的形成。
已公开了许多有关具免疫促进(immunotropic)活性或抗肿瘤活性的各种提取物、特别是泥炭(peat)的生产HyoshitaTakuya等人(Chem.Abstr.1974，00，47021j)报道了一个方法，其中，将泥炭用8%氢氧化钠溶液提取若干次;将得到的提取物酸化，离心分离固体颗粒，然后渗析并用柱层析纯化。这部分主要(95%)由多糖组成，并具有抗肿瘤活性。
St.Tolpa等人(在波兰专利第124110号中)描述了相同的泥炭提取液，但所不同的是，他们对该提取液进一步的处理不同酸化步骤后，进行碱化，然后再酸化，蒸发浓缩，中和，再浓缩，用醇-水混合物提取，然后再部分浓缩，并用醚或其它与水不互溶的有机溶剂提取，最后分出水层，并用凝胶过滤色谱柱纯化。但它未指出哪些部分可以被认为能成为较佳的最终产品。
与上述两文献所报道的碱性提取介质相反，波兰专利申请279.475(Tarchomi skie Zaklady，Farmaceutyczne POLFA，公开在BUP 24/90中)报导了用酸化的水性提取介质提取泥炭的方法。将该酸性提取液中和，用超滤法或反渗透法浓缩，所述反渗透法使用保留限(截止)为500-10000道尔顿的膜。然后将该产物用凝胶过滤柱色谱法或阴离子交换树脂柱分离。也可以获得盐浓度不同及多糖与糖蛋白的比率不同的部分。但它未指出所获得的所有混合物均无毒且显示出免疫促进活性。
上述方法有一些共同的特征。人们早就知道，在从天然原料中分离活性物质的同时，要保护该活性物质，因而可以避免可能是使该活性物质分解或失活的原因的次级反应。令人遗憾的是，先有技术均未报道为用各方法制备的产品(是各种物质的混合物)其生物活性之主要原因的化合物的确切结构或化学特性。很少有关于多糖和使用将低分子量部分除去的分离方法(渗析和超滤)的报道。这表明在所获得的产品中，生物活性可能是高分子量部分所导致的。
在对泥炭提取物目前的研究中发现，即使在保护条件下获得的提取物，或者具有较低的免疫促进活性，或者含有几乎不可分离的石碴(ballast)物质(主要是无机盐类)，这就限制了该产品在所需的药用制剂中的应用;在进一步的加工过程中，它们地增加了劳动和能耗，对于一些治疗应用，甚至拒绝使用该产品。
本发明的主要目的是提供提取植物和植物残渣及加工该提取物的新方法，用该方法可以较高产率获得具能促进细胞素生成的免疫促进特性的制剂;该方法克服了已知方法的缺陷。
我们出乎意料地发现当提取条件按以下特征之一或一个以上进行改变时，每批产品的免疫促进活性均保持在较佳的范围内且终产品中的有机物质的收率显著增加-所提取的化合物间的某些次级反应可按控制的方向并在可控的程度上有意进行，以便生成新化合物，这些新化合物在已知的如泥炭提取物中或者不存在，或者含量相当低;
-对如此得到的提取物的加工进行改良，以便在分离石碴物质(由天然泥炭中提取时和/或由提取介质带入的)时不会除去该提取物中有用和有益的成分。
与得自泥炭的制剂的生物活性和治疗活性相关的有机物质包括TTP(TOEPA TORF PREPARATION，波兰TORF CORPORATION的注册商标)，它们是Amadori重排化合物和在该醛糖和氨基酸反应产物的重排过程中得到的产物，即通式R1-CO-CH2-NH-R2化合物，式中R1是1-脱氧-2-酮-单糖、寡糖或多糖的残基，其中这样的1-脱氧-2-酮基团是碳原子链的端基;以及R2是氨基酸残基或肽残基，其中端基是与该肽键无关的游离NH2-基团。这些化合物的制备方法以及它们的药用用途公开在PCT/EP 93/00327中。
现已发现，可以获得这样的植物和植物残渣的提取物它们富含合成这些活性化合物所需的两类底物，一类是单糖、寡糖和多糖，另一类是氨基酸和肽，而且最终还包括作为上述反应的催化剂的具至少一个活性亚甲基基团的有机酸和/或化合物。
本方法可以生产出无毒制剂，如得自泥炭的制剂，所述制剂具免疫调节活性并促进细胞素(干扰素、肿瘤坏死因子等)在活生物体中生成，它们适用于人和动物的治疗和预防。对原料泥炭进行提取;将腐殖质在酸性环境下用沉淀法从得到的提取液中分出;用盐酸酸化至pH1.5-3.0;分离沉淀并将该提取液用减压蒸发浓缩和/或用超微过滤(nano-filtration)浓缩，同时去除无机盐类;将浓缩液的pH调至6.0-7.1;将得到的混合物浓缩至稠糖浆状并加热至70-90℃。最好加热至80℃直至氨基酸和/或肽产物的Amadori重排完全;所述氨基酸和/或肽产物的末端游离NH2-基团(与任何肽键无关)为合适的1-脱氧-2-酮糖-C1-基团所取代，这是由于由泥炭中提取的单糖、寡糖和多糖与氨基酸和/或肽的反应所致;然后通过将反应混合物冷却而终止该反应;将疏水物质(降低产品的免疫促进活性)用选择性吸附法从获得的反应后混合物中去除，所述选择性吸附用特异性的吸附树脂如AMBERLITE XAD型，最好是XAD-2或XAD-4，或任何其它具相似性质的树脂。
泥炭提取物最好首先是通过提取天然泥炭(可以首先用酸性溶液洗涤)所获得的碱提取物和水提取物的混合物，所述提取为先用碱水溶液然后再用水提取。较佳的原泥炭为低腐殖化度(humificationdegree)H6-H10。
Amadori重排反应最好在浓缩水溶液或浓缩水-醇溶液中进行。
由终产物中吸附待去除的物质最好在中性或微酸性溶液中进行;用蒸馏水和稀碱水溶液洗脱该柱。用喷雾干燥法从终溶液中分离出具生物活性和治疗活性的固体物质。
Amadori重排反应可以用检验反应即铁氰化钾与重排产物在碱性溶液中的还原反应来监控。在室温下，铁氰化钾在第1分钟内被还原剂如抗坏血酸还原，在头5分钟内被所需的重排产物还原，在头15-30分钟内被还原糖还原。还原产物亚铁氰化钾与硫酸亚铁生成普鲁士蓝。该反应可用于该重排反应的光度定量监控。按预定的时间间隔取反应混合物样，并对其进行该检验反应。当还原的样品中的普鲁士蓝强度不再增强时即中止该重排反应。
我们出乎意料地发现由加工底物如泥炭提取物的混合物生成所需的Amadori重排产物比在实验室中相同的糖和氨基酸的预混合组合物容易进行。
还测定出与类似的合成产物相比，泥炭提取物中所含的一些物质能增强本发明方法所获得的终制剂的生物有效性，而另一些物质则能降低该有效性。
用在本发明方法中的起始泥炭提取物富含糖和氨基酸，该提取物按文献所述方法获得。优选的原料是呈高度腐殖化(例如标度为H6-H10，见Moor-undTorf-Kunde编辑，Karl-HansGottlich，Stuttgart，1990年第3版)且碳与氮之比为15-35的低泥炭。
水提取物可由上述任何方法即使用酸性、中性和/或碱性水性提取介质的方法获得，最好是将这些方法配合起来。最好是将原泥炭先用酸性水溶液提取介质短时(1-2小时)提取，以除去无机物质如碳酸盐、金属氧化物等;然后用碱性水溶液提取介质(如0.2-0.6%NaOH溶液)于20-50℃长时(几小时至多于二十时)提取，以溶解腐殖酸和fulvoacid;最后用水、最好是蒸馏水于30-60℃再提取12或12小时以上;然后弃去酸提取液;将碱性和中性提取液合并，并按照本发明进行进一步处理。
人们知道，提取后的泥炭非常难于与提取液分离，需要昂贵的设备如离心分离器才能高收率地获得澄清的提取液。当使用特殊的提取器时，这些困难可以得到克服;在所述的提取器中，硬质泥炭是在固定床中，而提取介质在整个床中循环。提取方法的细节将在本说明书中的另一部分中描述。
按照本发明，将碱水提取液酸化至pH1.5-3.0，最好是2.3-2.5，以沉淀腐殖酸。6N盐酸是合适的酸化介质。在几小时至20多小时内沉淀物沉积下来，而且可以滗析出澄清的提取液。可以用离心或过滤法来收集该提取液的其余部分。
然后将该澄清溶液用旋转蒸发器浓缩至原体积的1/10。或者，可以在调节该溶液的pH值时用超微过滤法浓缩并除去无机盐。“超微过滤”一词用来定义改良的反渗透法，其中使用仅对于小分子如简单无机盐可渗透的膜。该膜的特点不在于保留时间，而更常常的是在于对NaCl的渗透性。已经发现，当用具40-60%的NaCl渗透性的HC50PP型膜时，或者用具66-74%的NaCl渗透性(丹麦Dow的产品)的CA865PP型膜时，可以得到满意的结果。用这样的膜或相似类型的膜所实施的本方法可将该溶液浓缩并同时除去电解质，几乎没有低分子量有机物质的任何损失，这些低分子量的有机物质被认为是本发明方法中最重要的(尽管在已知方法中，提取物中较高分子量的成分颇被认为是有用的成分)，并且是得到的所需最终产品的最终活性的原因之一。
刚才叙述的两个浓缩方法也可以依次用于相同的过程中。最好是，先将溶剂在旋转真空蒸发器中蒸发;然后将溶液中和并进行超微过滤直至达到每100ml溶液中有8-12g干固体的浓度时止。若由于某些特殊应用需要高度脱盐，即低含量的无机盐，可将该溶液在用蒸馏水超微过滤(透析滤过)的过程中以定期或连续的方式稀释。尺寸较大的阳离子如Ca、Fe、Al离子迁移通过该膜要慢得多，可以在超微过滤操作开始前通过使该待浓缩溶液通过装有钠型的弱离子交换剂(例如AMBERLITEEIRC50)的柱而用钠阳离子来取代。
在超微过滤结束时，控制剩余溶液的pH，若有必要，将其调至pH6.0-7.2，最好是pH6.5-6.8。然后将该溶液置旋转真空蒸发器中，于35-40℃浓缩至约为其原体积的一半(直至获得糖浆状粘稠的溶液时止)。然后在常压及不断搅拌下，将溶液的温度升至70-90℃，最好是升至80℃，并继续加热。在开始时每隔30分钟取一次样，1.5小时后每隔15分钟取一次样。通过测定上述检验反应的颜色强度来监视反应的进展。若所取样品的检验反应的颜色强度与前面样品的相同或较之减弱，则通过将加热浴迅速冷却来终止该反应。
或者，该反应可以按下述方式进行将反应混合物按前述相同的浓缩方法浓缩，然后将其用足以溶解该产物的50%乙醇水溶液稀释;然后将稀释溶液加热回流，并按上述方法监视和控制反应的进展，只是在对各样品进行检验反应前将其中的溶剂蒸发。当反应完全时，减压蒸出醇。
在测定出反应后混合物中干固体的含量后，将其用蒸馏水稀释，以获得10-12%溶液;然后使其缓慢通过装有非离子吸附树脂的柱子，所述树脂为XAD型(Roehm&Haas的产品)，最好是XAD-2或XAD-4型。在与这样的吸附剂接触时，疏水物质被吸附的力量最强，而对亲水物质如糖则吸附力最弱。收集流过该柱的液体。然后用蒸馏水洗脱该柱，并将洗脱液按流份分别收集。将各流份进行层析分析和/或用生物检定法测定其活性。然后将开始通过该柱的液体与对其所需活性进行选择后挑出来的洗脱液流份合并，以获得能达到用不同试验和生物测定测得的预定的活性比值的产品。生物测定详见下述。然后用稀碱溶液洗脱被最强吸附的物质，直至洗脱液仍呈中性时止。将含有对终制剂的生物活性有强抑制作用的物质的其它流份弃去。
将在上一步所获得的溶液用膜过滤消毒并在无菌条件下在喷雾干燥器中干燥，在喷雾干燥时，进气温度为180-185℃，出口气温为约80℃。
得到的粉末为米色。当将其于室温、不透气的容器中并在暗处贮存时，其生物活性可保持一年以上。
上述终产品的活性已通过进行以下显示该制剂对免疫系统的个体反应的作用的试验进行了评估1.按照Bach和Dardenn提出的方法(Cell.Immunol.3，1-16，1972)测定形成E-玫瑰花结(rosettes)的脾细胞的百分数2.按照Jerne提出的方法，根据Mishell和Dutton(J.Exp.Med.126，423-442，1967)的改良，测定产生IgM型的溶血抗体的脾细胞的数目3.按照Adler提出的方法(J.Immunol.95，26-38，39-47，1965)测定在活性血细胞凝集试验中的血凝集19S+7S和7S抗体。
4.小鼠胸腺细胞在用氢化可的松的20小时的培养中的存活试验(细胞毒试验)5.干扰素和TNF诱导试验(PCT/EP93/00327)
在所有以上所列的试验中，与盲对照组(blindcontrols)相比，已证实按照本发明所获得的产品在浓度为0.05-1mg/kg(试验1-3)、0.05-10μg/ml(试验4)和10-100μg/ml(试验5)时就已经具有促进作用了。
就按照本发明所获得的产品的其它性质来说，需要强调属于波兰卫生部在TTP(ToEpaTorf制剂)的批准证书中所定的在对该制剂的分析标准中所规定之列的有关性质。
用于获得来自泥炭的生物活性产品的本方法的产率比按照波兰专利第124110号的传统方法的高10倍。这就意味着作为原料的有价值的泥炭的用量减少了。而且，碱提取后，提取后的泥炭如今用水洗涤，因此最终是中性的(不被碱或酸所污染)而且对环境安全;它在生态学方面是无害的，可直接用于农业。
此外，在本发明方法中未使用任何易燃的有机溶剂如乙醚。由于活性物质的较高浓度，加之其低分子量，因此当口服时，该制剂比按传统方法获得的TTP更易被吸收。
在以下实施例中详细描述本发明。
实施例1将45kg含水量为64-65%的泥炭粉碎，过14mm孔径的筛，然后装入专为提取泥炭设计的半工业规模的提取器中。使提取介质0.4%氢氧化钠由180l供应槽中以非常慢的流速流过泥炭床，以使提取器中的液体高度按约1cm/分钟增加。当整个泥炭床被提取介质覆盖时，将流速增至500l/分钟。使提取液于40±2℃再循环27小时后关闭进料泵;将进料阀与120l蒸馏水的另一槽接通并使该洗液于相同温度再连续循环16小时。
将碱提取物和水提取物合并，滗析出提取液，得到总体积为240l的液体，pH＝12.1。将该总量分成两部分再进一步处理。
实施例2将在实施例1所述操作中所获得的120l提取液用1.616N盐酸酸化至pH2.1。使酸化的混合物沉降24小时。然后滗出75升澄清溶液，并经过过滤又回收25升。将澄清溶液合并并在旋转玻璃蒸发器(SIMAX)中减压浓缩至体积为19升。通过加入氢氧化钠调节该浓缩溶液的pH值至6.8。得到的溶液接近中性，将其用蒸馏水稀释至总体积为50l并在Lab Unit M20(Dow分离系统产品，丹麦)中进行超微过滤，该实验装置配有HC50PP型的平膜。在20个大气压和21℃的温度下，该膜的总过滤面积是0.36m2。滤液的最终体积是7升。浓缩的提取液的pH值为6.6，因此无需作任何调节。
将上面获得的浓缩提取液装入真空旋转蒸发器(BUCHI，瑞士)中并进一步减压浓缩至体积为1.3l。然后在常压下将该溶液加热至80℃，将其通过旋转不断搅拌继续加热。所需反应的进展通过测定所取样品在铁氰化钾的还原试验后的颜色强度来监视。135分钟后颜色强度稳定或者甚至略有减弱。通过将反应混合物冷却至20℃来终止反应。将反应后混合物置于较小的(实验室规模)蒸发器中再减压浓缩至体积为800ml，其干固体的含量为13.25g/100ml。将浓缩的溶液过滤并使其以0.8ml/分钟的速度通过直径为26mm、内装270ml吸附剂XAD-2的柱子。收集液体。并将该柱用蒸馏水洗脱。收集3个连续流份(1-3)，每份的体积分别为160ml、240ml和400ml。然后用0.1%氢氧化钠溶液作洗脱剂并收集液体直至洗脱液的pH值大于7.0时止。第4流份(220ml)的pH值为7.0。这些流份的组成用层析法(HPLC)来测定。将流份1、2、300ml流份3和150ml流份4合并，浓缩至100ml，然后与引至该柱的液体的流出部分合并。将该最终溶液通过在无菌条件下用具0.22μm微孔的膜过滤消毒，然后在无菌条件下在喷雾干燥器中干燥;在喷雾干燥时，进气温度为185℃，出口气温度为81℃。所得粉末的总量为96g。
实施例3将另一部分的120l提取液酸化(同上述实施例2)至pH2.3;将腐殖土沉淀按以上实施例2中所述分离，获得98l酸化的澄清溶液。将该溶液用4NNaOH中和至pH6.7并放置12小时，然后过滤并在与实施例2中所述的同样的条件下进行超微过滤，最终滤液的体积为10l。然后加入20l蒸馏水并将得到的溶液浓缩至10l。然后再加入20l蒸馏水，将得到的溶液最终浓缩至7l。按实施例2中的同样方法进行进一步处理，只是Amadori重排化合物和产物的形成持续110分钟。最终粉末的产量为84g。
权利要求
1.具免疫调节活性并能促进细胞素在活体中生成且适宜于人和动物的治疗和预防用的制剂的生产方法，其中，提取原植物和植物残渣并用在酸性环境中沉淀的方法将得到的提取液与腐殖质分离，其特征在于-用盐酸酸化至pH1.5-3.0并分离沉淀物而将腐殖质从泥炭提取液中除去，然后将提取液通过减压蒸发和/或同时除去无机盐的超微过滤来浓缩，将浓缩溶液的pH调至6.0-7.1；-将得到的混合物浓缩至稠糖浆状并加热至70-90℃，最好加热至80℃直至氨基酸和/或肽产物的Amadori重排完全，所述氨基酸和/或肽产物的末端游离NH2-基团(与任何肽键无关)为合适的1-脱氧-2-酮糖-C1-基团所取代，这是由于由泥炭中提取的单糖、寡糖和多糖与氨基酸和/或肽的反应所致；-通过将反应混合物冷却而终止该反应，将疏水物质(会降低产品的免疫促进活性)用选择性吸附法除去，所述选择性吸附法用特异性的AMBERLITE型吸附树脂，最好是XAD-2或XAD-4型或具相似性质的其它树脂。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，起始提取液是用下述方法获得的碱提取液和水提取液的混合物将天然的原泥炭、最好是腐殖化度为H6-H10的低泥炭用碱水溶液提取，然后用水提取，所述原泥炭在用碱水溶液提取前可先用酸性溶液洗涤。
3.按照权利要求1或2的方法，其特征在于Amadori重排反应在浓缩的水溶液或浓缩的水-醇溶液中进行。
4.按照上述权项中任一权项的方法，其特征在于使待从最终产品中去除的物质从其酸性或中性溶液吸附至柱中，然后用蒸馏水和稀碱溶液洗脱该柱。
5.按照上述权项中任一权项的方法，其特征在于该最终溶液可以在灭菌后喷雾干燥。
全文摘要
具免疫调节活性并能促进细胞素(干扰素、肿瘤坏死因子等)生成的无毒制剂，适用于人和动物的治疗和预防；它可通过提取植物和植物残渣来制备。
文档编号A61K35/10GK1105569SQ9410032
公开日1995年7月26日 申请日期1994年1月22日 优先权日1994年1月22日
发明者J·Z·米奥杜祖斯基, K·韦特基维兹, M·科瓦斯卡, J·戈拉尔, M·克林梅卡 申请人:托夫企业公司