专利名称：一种β-环糊精配基琼脂糖氢键吸附纯化缩宫素的方法
技术领域：
本发明涉及一种化学合成多肽药物一缩宫素的氢键吸附色谱分离纯化方法，具体的是采用表面键合了 β-环糊精配基的琼脂糖凝胶介质，利用氢键吸附色谱原理分离纯化化学合成缩宫素。
背景技术：
自然界存在着数量庞大、种类繁多的生物活性肽，涉及各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等，在各种生命活动中起着重要的调节作用，广泛参与分子识别、信号转导、 酶活调节、免疫调节、细胞分化及个体发育调控等过程。自从上世纪初多肽人工合成技术发明以来，已经有几十种人工合成多肽药物上市，并被广大患者采用。随着近年来频频爆发食品、药品安全问题，以及人们对药品质量和使用安全性意识的提高，多肽药物生产的纯度标准与质量控制又重新受到各有关方面的重视。缩宫素(oxytocin，0T)于1895年被发现，结构如图1所示，是具有一个二硫键的九肽酰胺，又名催产素，是一种哺乳动物激素，主要由下丘脑视上核和室旁核的神经分泌大细胞系统分泌产生，从垂体后叶释放入血液，沿血液循环到达远端的器官发挥作用，在临床上被广泛用于引产、催产及预防因分娩后子宫乏力引起的大出血，是目前美国FDA唯一认可用于临床引产的药物。其分子量1007. 2Da，分子式C43H66N12O12S2,等电点7. 7，易溶于水， 溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品稳定，PH3. 8 4. 4的酸性溶液中较稳定，碱性溶液中不稳定。早年药用缩宫素的生产采用从动物垂体后叶组织中提取的方式，存在病毒灭活、除过敏原、除热原等安全性问题，且提取物中存在难分离结构近似物，即后叶加压素。我国自1969年第一次合成缩宫素以来，国内30余家缩宫素制剂生产厂家均采用九肽酰胺经钠-液氨法消除、缩合的办法合成缩宫素，最终产品的纯化过程较复杂，产品纯度低、收率低，这也是导致临床出现部分不良反应的因素之一。化学合成缩宫素粗品中的主要杂质，是一些与目标多肽结构类似的杂肽，例如氨基酸消旋化产生的非对映异构体、部分氨基酸未连接上产生的缺失肽、肽键断裂产生的断裂肽，以及氧化不彻底产生的还原态开环肽等。人工合成多肽药物的传统纯化方法是多步反相色谱纯化，反相色谱法是目前分辨率最高的多肽纯化方法，可以精确分辨一个氨基酸残基的差异，因此除了作为纯化方法外， 还经常被用作最终的纯度验证步骤。尽管已有商品化的制备级反相色谱柱，但将反相色谱技术应用于多肽药物的规模化生产还有不足第一，反相高效液相色谱的样品载量较低，尤其是对杂质较多的粗品，过量粗制样品会造成色谱柱的不可逆塌陷；第二，介质品种有限， 不易放大；第三，介质的重复使用次数有限，对样品的预处理要求较高；第四，常规硅胶基质键合烷基配基，这样的色谱分离介质，用作临床用药的生产，其生物相容性与生物安全性没有葡聚糖、琼脂糖类的介质高。琼脂糖凝胶介质是天然多糖类色谱介质，发明于20世纪60年代，具有理想介质的许多特性高孔度(90-96% )，即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积提供了很高的吸附能力；易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现色谱柱的再装填)，又可通过适度的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；表面具有大量亲水羟基，可被不同功能配基取代而应用于多种吸附色谱技术。β -环糊精是一种具有桶状结构的多糖分子，结构如图2所示，内部具有疏水空腔，外表面具有丰富的亲水羟基和醚键，能够提供氢键形成位点，主要作为药物载体，与药物分子形成包合物，目的是增加药物分子的亲水性，改善药物分子在循环系统中的溶解度与释放速率。β-环糊精分子本身还具有一定的手性选择性。氢键吸附色谱是利用色谱介质与目标分子之间形成氢键作用的强弱实现分离的一类新型色谱分离方法，利用不带有任何配基的高浓度、高交联度琼脂糖凝胶本身作为氢键吸附色谱介质，分离纯化中药多酚类化合物或多肽的机理及应用研究已有报道。
发明内容
本发明的目的在于采用自制的可规模放大的以β -环糊精为配基的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质，分离纯化化学合成缩宫素粗品，简化纯化工艺，提高目标物选择性、产品回收率、产品纯度和生物安全性，提高样品载量和介质重复利用度。本方法适用于液相合成或固相合成的化学合成缩宫素粗品。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种以交联琼脂糖凝胶为基质、以β-环糊精为配基的氢键吸附色谱介质的合成方法，包括如下步骤1)12%浓度、30 μ m平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；2)加入 100-200ml 水，加 5_15g 硫酸钠，搅拌 2_3h ；3)加入 100-200ml 水和 50_60ml 的 20-50 % 的氢氧化钠，60rpm 搅拌；4)加入30_60ml环氧化试剂，包括环氧氯丙烷和1，4_ 丁二醇-二缩水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 搅拌，反应 6_8h ；5)用盐酸调 pH 4-6;6)加入20-50mg β -环糊精，20-50 %的氢氧化钠，20-30 °C，60rpm搅拌，反应 12-20h ；7)用盐酸调pH 4-6，水洗10个柱床体积；8)保存于20%乙醇中备用。本发明提供一种β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱分离纯化化学合成缩宫素的方法，具体步骤如下1)流动相组成乙腈-乙酸-水体系，初始流动相为20-30%乙腈，配制好的流动相用0. 45 μ m滤膜过滤，超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0. 5_lh备用；2)化学合成缩宫素粗品溶解于初始流动相，配制成10 50mg/mL溶液，超声助溶 1 5min, 0. 45 μ m滤膜过滤；3) β-环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质装柱，用初始流动相平衡2个柱床体积后进样，样品体积为柱床体积的5 50% ；
4)洗脱方式初始流动相等度洗脱2个柱床体积后，纯水等度洗脱2个柱床体积，然后采用O 10%乙酸线性梯度洗脱，梯度长度为5 10个柱床体积，线性流速20 100cm/h ；5)紫外检测器^Onm在线监测，自动收集馏分；6)将步骤幻收集的馏分冷冻干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，进行纯度检测采用反相高效液相色谱C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水为流动相体系，线性梯度洗脱，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为梯度起点，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)为梯度终点，梯度长度30min，紫外检测器210nm在线监测，计算缩宫素纯度和收率。本发明提供了一种使用自制β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化化学合成缩宫素的方法，是对现有多肽分离纯化方法的有益补充，与传统多步反相色谱技术相比的优势在于一步分离可获得较高纯度的多肽，回收率高；介质对粗品耐受强， 样品载量高，介质可重复利用数十次，易于规模放大；介质的生物相容性与生物安全性高。
图1缩宫素分子结构图2β_环糊精分子结构图3实施例1中采用β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化液相合成缩宫素粗品色谱4实施例2中采用β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化固相合成缩宫素粗品色谱图
具体实施例方式实施例1、β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化液相合成缩宫素粗品(初始纯度约17%)1)流动相组成乙腈-乙酸-水体系，初始流动相为30%乙腈，配制好的流动相用 0. 45 μ m滤膜过滤，超声脱气或真空脱气20min，室温静置0. 5h备用；2)化学合成缩宫素粗品溶解于初始流动相，配制成50mg/mL溶液，超声助溶5min， 0. 45 μ m滤膜过滤；3) β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质装柱，柱床直径10mm，柱床高度 30cm，用初始流动相平衡2个柱床体积后进样，样品体积为柱床体积的10% ；4)洗脱方式初始流动相等度洗脱2个柱床体积后，纯水等度洗脱2个柱床体积， 然后采用O 10%乙酸线性梯度洗脱，梯度长度为10个柱床体积，线性流速40cm/h ；5)紫外检测器^Onm在线监测，自动收集馏分；6)将步骤幻收集的馏分冷冻干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，进行纯度检测采用反相高效液相色谱C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水为流动相体系，线性梯度洗脱，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为梯度起点，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)为梯度终点，梯度长度30min，紫外检测器210nm在线监测；7)纯化后，缩宫素纯度由17%提高至96%，回收率78%。
实施例2、β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化固相合成缩宫素粗品(初始纯度约58%)3)流动相组成乙腈-乙酸-水体系，初始流动相为20%乙腈，配制好的流动相用 0. 45 μ m滤膜过滤，超声脱气或真空脱气20min，室温静置0. 5h备用；4)化学合成缩宫素粗品溶解于初始流动相，配制成50mg/mL溶液，超声助溶3min， 0. 45 μ m滤膜过滤；幻β-环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质装柱，柱床直径16mm，柱床高度 30cm，用初始流动相平衡2个柱床体积后进样，样品体积为柱床体积的20% ；4)洗脱方式初始流动相等度洗脱2个柱床体积后，纯水等度洗脱2个柱床体积， 然后采用O 10%乙酸线性梯度洗脱，梯度长度为10个柱床体积，线性流速30cm/h ；5)紫外检测器^Onm在线监测，自动收集馏分；6)将步骤幻收集的馏分冷冻干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，进行纯度检测采用反相高效液相色谱C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水为流动相体系，线性梯度洗脱，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为梯度起点，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)为梯度终点，梯度长度30min，紫外检测器210nm在线监测；7)纯化后，缩宫素纯度由58%提高至98%，回收率85%。
权利要求
1.一种采用以β-环糊精为配基的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质分离纯化化学合成缩宫素的方法。分离纯化方法具体如下1)流动相组成乙腈-乙酸-水体系，初始流动相为20-30%乙腈，配制好的流动相用 0. 45 μ m滤膜过滤，超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0. 5_lh备用；2)化学合成缩宫素粗品溶解于初始流动相，配制成10 50mg/mL溶液，超声助溶1 5min, 0. 45 μ m滤膜过滤；3)β -环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质装柱，用初始流动相平衡2个柱床体积后进样，样品体积为柱床体积的5 50% ；4)洗脱方式初始流动相等度洗脱2个柱床体积后，纯水等度洗脱2个柱床体积，然后采用0 10%乙酸线性梯度洗脱，梯度长度为5 10个柱床体积，线性流速20 IOOcm/ h；5)紫外检测器^Onm在线监测，自动收集馏分；6)将步骤幻收集的馏分冷冻干燥，用15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解配制成 0. 2mg/mL溶液，进行纯度检测采用反相高效液相色谱C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水为流动相体系，线性梯度洗脱，15%乙腈(含0. 三氟乙酸)为梯度起点，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)为梯度终点，梯度长度30min，紫外检测器210nm在线监测，计算缩宫素纯度和收率。
2.权利要求1中琼脂糖凝胶介质偶联β-环糊精配基的步骤包括1)12%浓度、30μ m平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；2)加入100-200ml水，加5_15g硫酸钠，搅拌2- ；3)加入100-200ml水和50_60ml的20-50%的氢氧化钠，60rpm搅拌；4)加入30-60ml环氧化试剂，包括环氧氯丙烷和1，4-丁二醇-二缩水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 搅拌，反应 6_8h ；5)用盐酸调pH4-6 ；6)加入20-50mgβ-环糊精，20-50%的氢氧化钠，20-30°C，60rpm搅拌，反应12_20h ；7)用盐酸调pH4-6，水洗10个柱床体积；8)保存于20%乙醇中备用。
3.权利要求1中要求的应用对象，化学合成缩宫素，包括液相合成与固相合成的缩宫素。
全文摘要
本发明涉及一种使用氢键吸附色谱分离纯化化学合成缩宫素的方法。此方法采用表面键合了β-环糊精配基的高浓度、高交联度的琼脂糖凝胶介质，根据氢键吸附原理，从化学合成(包括液相合成和固相合成)的缩宫素粗品中，分离纯化缩宫素，用于缩宫素原料药的生产，具有选择性高、样品载量高、介质重复利用度高等优点，克服传统反相色谱法的介质重复利用度低、样品载量低的缺点。
文档编号C07K1/34GK102250218SQ20111017751
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者俞保彬, 周天琼, 周正兵, 谷海涛, 顾铭, 高留根 申请人:中国科学院过程工程研究所, 杭州华津药业股份有限公司