海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，以及该种多糖在 细菌和植物病原菌的生长抑制、过氧化物的清除、抗肿瘤和抑制微核形成方面的应用。
【背景技术】
[0002] 海参属棘皮动物门入海参纲动物(//〇/〇全世界约有 1200种海参，主要生活在热带和温带的海洋中，常见的可食海参有刺参、梅花参、白瓜参，这 些海参除了食用价值之外，还含有丰富的生物活性物质，如海参毒素、海参多糖、海参皂苷、 脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等，这些成分具有多种生物活性。另海参体内及肠道内生活 着大量的细菌，这些细菌代谢产物具有独特的结构与功能，但这些代谢产物迄今未止还没 有被充分利用。
【发明内容】
[0003] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种操作简单、成本低廉的 海参共附生枯草芽孢杆菌HS22(Bacillus subtilis HS22)的胞外多糖的制备方法，以及该 多糖细菌和植物病原菌的生长抑制、过氧化物的清除、抗肿瘤和抑制微核形成方面的应用。
[0004] 本发明的技术解决方案是：一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法， 其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行： a、 将淀粉、硝酸钾、NaCl、K2HP04、MgS04、FeS04混合到水中形成培养基溶液，且各组分 的质量百分比为淀粉：1. 5%，硝酸钾：2%，NaCl :0. 05%，K2HP04 :0. 05%，MgS04 :0. 05%，FeS04 : 0. 001%，并将培养基溶液的pH值调节至5， b、 取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22,将其按照1:800-1000的比例与培养基溶液混合， 在温度为35-40°C，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液； c、 将发酵液在6000rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙 醇，4°C沉淀14-16h，然后在9000rpm的条件下离心30min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后， 利用savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并在4°C沉淀14-16h，然后再次在 9000rpm的条件下离心30min，取沉淀，沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。
[0005] 所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑制细菌和植物病原菌生长方面的应 用。
[0006] 所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在过氧化物的清除方面的应用。
[0007] 所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抗肿瘤方面的应用。
[0008] 所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抑制微核形成方面的应用。
[0009] 本发明同现有技术相比，具有如下优点： 本发明所公开的海洋芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其操作简单，成本低廉，能够稳定 的获得海参共附生枯草芽孢杆菌的胞外多糖；同时利用该方法制备的海参共附生枯草芽孢 杆菌胞外多糖，具有较强的抗氧化活性，能够抑制蚕豆根尖细胞微核的形成，可以广泛应用 于医药抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、仿佛和化妆品添加剂等领域，具有广泛的市场前景和 产业价值。
【附图说明】
[0010] 图1是海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对微核形成的抑制率。
【具体实施方式】
[0011] 下面将说明本发明的【具体实施方式】。
[0012] 一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于所述的方法按照 以下步骤进行： 首先配置培养基溶液。将淀粉、硝酸钾、似(：1、1(2即04、1%304、？以04混合到水中形成培 养基溶液，且在培养基溶液中各组分的质量百分比为淀粉：1. 5%，硝酸钾：2%，NaCl :0. 05%， K2HP04 :0? 05%，MgS04 :0? 05%，FeS04 :0? 001%，并将培养基溶液的 pH 值调节至 5 ; 然后取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)，该菌株已于2013 年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号： CGMCC No: 7080 ;将其放置在培养基溶液中，HS22与培养基溶液的比例为1:1000 ;在温度 为35-40°C，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液； 将发酵液在6000 rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙醇， 4°C沉淀16h，然后在9000 rpm的条件下离心30 min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后，利用 savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并4°C沉淀16h，然后再次在9000 rpm的 条件下离心30 min，取沉淀，所获得的沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。
[0013] 海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑菌活性的测定。
[0014] 抑真菌活性的检测：苹果粉红单端孢霉，番茄灰霉和毛霉均受赠于中科院大连化 学物理研究所。将各菌种分别接种于沙氏固体培养基中，静置培养5-7 d作指示菌。
[0015] 取海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的溶液400 ML，与10 mL沙氏固体培养基在 60 mm培养皿中混匀，使多糖终浓度分别为100 Pg/mL、200 Pg/mL和300吒/mL，待培养基 凝固后，用打孔器在事先培养好的好的长满指示菌的平板上打孔，用镊子小心取出带有指 示菌的琼脂块，倒置于凝固好的固体培养基中央，空白对照加入400 ML的无菌水，每种植物 病原菌做3个重复。28°C培养至空白对照培养基上的指示菌布满整个培养皿，观察并记录 菌落直径计算抑制率，方法是按照十字交叉测量2次，以其平均值代表菌落直径的大小。根 据抑制率的计算公式：纯生长量=菌落平均直径一菌饼直径，抑制率=(对照纯生长量一处 理纯生长量）/对照纯生长量进行计算。结果该海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖对三种 指示真菌的抑制率如下表所示：
【主权项】
1. 一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述的方法按照 以下步骤进行： a. 将淀粉、硝酸钾、NaCl、K2HP04、MgS04、FeS04混合到水中形成培养基溶液，且各组分 的质量百分比为淀粉丄 5%，硝酸钾：2%，NaCl:0? 05%，K2HP04 :0? 05%，MgS04 :0? 05%，FeS04 : 0. 001%，并将培养基溶液的pH值调节至5， b. 取海参共附生枯草芽孢杆菌HS22,将其按照1:800-1000的比例与培养基溶液混合， 在温度为35-40°C，转速为150-200rpm的条件下摇床振荡培养3-5d，获得发酵液； c. 将发酵液在6000rpm的条件下离心并去除沉淀，向上清液中加入2倍体积的95%乙 醇，4°C沉淀14-16h，然后在9000rpm的条件下离心30min，将得到的沉淀用蒸馏水溶液后， 利用savage法去除蛋白后，再加入2倍体积的95%乙醇并在4°C沉淀14-16h，然后再次在 9000rpm的条件下离心30min，取沉淀，沉淀即为海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖。
2. -种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在 于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖抑制细菌和植物病原菌生长方面的应用。
3. -种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在 于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在过氧化物的清除方面的应用。
4. 一种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在 于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抗肿瘤方面的应用。
5. -种如权利要求1所述的方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，其特征在 于：所述的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖在抑制微核形成方面的应用。
【专利摘要】本发明公开一种海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖的制备方法，其操作简单，成本低廉，能够稳定的获得海参共附生枯草芽孢杆菌的胞外多糖；同时利用该方法制备的海参共附生枯草芽孢杆菌胞外多糖，具有较强的抗氧化活性，能够抑制蚕豆根尖细胞微核的形成，可以广泛应用于医药抗肿瘤、生物防治、食品保鲜、仿佛和化妆品添加剂等领域，具有广泛的市场前景和产业价值。
【IPC分类】C08B37-00, C12P19-04, A61P35-00, C12R1-125, A61K31-715
【公开号】CN104694594
【申请号】CN201310644111
【发明人】张付云, 刘晔, 王维才, 赵宇, 李振
【申请人】大连海洋大学, 张付云
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月5日