一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于荧光辅助糖电泳技术领域，具体涉及一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析检测不同木聚糖酶功能的方法。
【背景技术】
[0002]在木质纤维素中木聚糖是继纤维素之后最为丰富的植物细胞壁多糖，但是木聚糖的结构组成却明显复杂于纤维素。木聚糖骨架是由木糖残基通过β_1，4糖苷键连接而成，并被L-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸及4-0-甲基葡萄糖醛酸等侧链糖基取代。由于木聚糖结构组成复杂，导致对其降解利用需要复杂的酶系。降解木聚糖骨架的酶主要包括I，4-13_D-木聚糖酶、β-木糖苷酶，侧链的去除主要由L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶等完成。在木聚糖降解酶系中，I，4-13_D-木聚糖酶在将木聚糖降解为木寡糖中发挥着重要的作用，降解产生的木寡糖可以在木糖苷酶的作用下完全转化成木糖。木寡糖已于2008年被中国卫生部批准为新功能性食品(2008，卫生部)，它具有高效、稳定、安全、无毒等优点，因此越来越多地被用于食品、饲料、医药等领域。而木糖在生物燃料的生产中具有重要应用价值。I，4_β-D-木聚糖酶的功能差异及与β-木糖苷酶的比例决定着木寡糖的种类及木糖的产量。农业废弃物玉米芯中含有丰富的可利用木聚糖，通过不同酶系的作用可以产生不同种类价值的产品，因此，快速确定不同木聚糖酶的功能差异及酶系中酶与酶之间的协同对复配特定的降解酶系用于不同的生产需求具有重要意义。
[0003]木聚糖酶的功能差异主要通过酶解产物反映，目前，对于木聚糖的复杂酶解产物，特别是低聚木糖尚缺乏快速、灵敏和可定量的分析方法。常用的方法有薄层层析(TLC)技术、高效液相色谱(HPLC)法等。TLC检测过程中容易使复杂样品扩散、拖尾从而影响分离和定量结果，而HPLC对糖的检测灵敏度不高，尤其是对木寡糖的分离效果不佳。荧光辅助糖电泳(FACE)使用焚光基团标记单糖、寡糖和多糖还原端，8-萘胺-1，3，6_三磺酸(ANTS)和7-萘胺-1，6_二磺酸(ANDS)经常用作荧光标记物，其氨基基团可以与糖环呈打开状态的单糖或寡糖形成席夫碱，再经过一种合适的还原剂(NaCNBH3)还原，使荧光标记物的耦合变为不可逆反应，使木聚糖酶解产物可以在凝胶上得以有效的分离，并通过灵敏的荧光成像系统进行鉴定分析。但检索发现有关利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法还未见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法。
[0005]本发明所述利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法，步骤是:
[0006](I)利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉，获得玉米芯木聚糖；
[0007](2)用不同待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解；
[0008](3)利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析；
[0009](4)根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待鉴定木聚糖酶功能的差异；
[0010]其特征在于:
[0011 ]步骤(I)所述利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉的方法是:
[0012]①将烘干后的玉米芯粉碎成粒径为0.2±0.1mm的颗粒，过80目筛子，获得粒径均一的玉米芯粉；
[0013]②将制得的粒径均一的玉米芯粉按质量体积比1:8-9的比例加入蒸馏水，于105土2 °C预处理40-50min，然后用8层纱布过滤，收集滤渣；
[0014]③将滤渣烘干后研磨l-2h;
[0015]④研磨后加入与①所述蒸馏水体积相同量的浓度为15%(w/v)的氢氧化钠溶液，于115 ± 2 °C下蒸煮40-50min，然后用8层纱布过滤，收集滤液；
[0016]⑤滤液用浓度为30%(w/v)的氢氧化钠溶液对其进行脱色处理0.5-lh;
[0017]⑥脱色处理后的溶液用浓度为15% (w/v)的三氯乙酸溶液脱蛋白，其中所述溶液与三氯乙酸溶液的体积比为8:1;
[0018]⑦将脱蛋白后的溶液以8000r/min离心30min，收集上清液，然后加入浓盐酸将该溶液的pH调至6.0;
[0019]⑧加入⑦制得的溶液3倍体积量的无水乙醇，醇沉12-20h，然后8000r/min离心20min，收集的沉淀物即为木聚糖粗提物；
[°02°]⑨将木聚糖粗提物用三蒸水充分搅拌清洗，再8000r/min离心20min，收集沉淀物，如此重复3次；
[0021]⑩将⑨制得的沉淀物于-20°C冷冻干燥12_20h，得到纯木聚糖粉末，再研磨1.5-3h，研磨后的粉末过100?200目筛子，即得到粒径均一超细的聚合度在40-100范围内的玉米芯木聚糖；
[0022]步骤(2)所述用不同待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的方法是:
[0023]①利用磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液将步骤(I)制得的玉米芯木聚糖配成浓度为1%的且pH适于待鉴定木聚糖酶反应的木聚糖溶液；
[0024]②将制备的木聚糖溶液与蛋白浓度为0.0lmg/mL的待鉴定木聚糖酶溶液按体积比为6:4混合，在该待鉴定木聚糖酶的最适温度条件下分别进行时间为2min、5min、15min、3011^11、601^11、1201^11、2401^11的序列反应，其间以沸水作用101^11终止反应，分别以1000(^/min离心1min，收集各时间段的待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的产物；
[0025]步骤(3)所述利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析方法是:
[0026]①分别取步骤(2)制得的待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的产物进行荧光标记，然后分别取制备的焚光标记产物0.2yg?5yg点样，点样时最外侧两个孔道不点样以避免边缘效应，其他孔道隔一个孔道点一个样以防止样品因胶内横向扩散使条带成片，影响定量分析，在冰水浴条件下，以恒流5mA/胶板进行荧光辅助糖电泳，时间3-4h;
[0027]其中，所述荧光辅助糖电泳中聚丙烯酰胺分离胶、浓缩胶中各组分及浓度是:
[0028]聚丙烯酰胺分离胶配方:35 %丙烯酰胺，375mM、pH 8.8Tris_HCl ,0.1%过硫酸铵以及 0.02% TEMED;
[0029]聚丙烯酰胺浓缩胶配方:5%丙烯酰胺，62.5mM、pH 6.8Tris-HCl ,0.1 %过硫酸铵以及 0.02% TEMED;
[°03°]分呙胶加入量为4.1mL/胶板；
[0031 ]其中，所述荧光标记中荧光标记物配制方法是:
[0032]ANDS: ANDS加入到15%冰醋酸溶液中，终浓度0.2M(71.87mg/ml，过饱和溶液)；
[0033]NaCNBH3:NaCNBH3加入到二甲基亚砜中，终浓度IM;
[0034]其中，所述将玉米芯木聚糖实施酶解后的产物进行荧光标记的方法是:
[0035]分别取一定体积的待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的产物，分别加入其相同体积的0.2 M A N D S后，室温避光放置1- 2 h，然后加入与酶解产物相同体积的IMNaCNBH3，42°C孵育12_14h; 8000r/min离心1min，收集溶液，开盖放置30min，以挥发掉管内的HCN气体，然后加入3倍酶解产物体积的50% (m/v)蔗糖上样缓冲液，完成荧光标记产物制备;
[0036]其中，所述荧光辅助糖电泳中电泳所需缓冲液内液、外液中各组分及浓度是:
[0037]电泳缓冲液内液:9.38%三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2.422%甘氨酸；
[0038]电泳缓冲液外液:1.23 %三羟甲基氨基甲烷(Tr i s )、6.18 %硼酸、3.72 %EDTA.Na2；
[0039]其中，所述荧光辅助糖电泳中使用Imm胶板，15孔梳子，二十几个样品使用小型垂直凝胶电泳系统，二十几个样品以上使用高通量垂直凝胶电泳系统(B1-Rad，USA);
[0040]②利用荧光成像系统对荧光辅助糖电泳凝胶扫描，获得TIF格式图片，提取图片中各条带灰度值以此定量分析待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖各时间段实施酶解产物中相应的各寡糖的量；
[0041 ]步骤(4)所述根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待鉴定木聚糖酶功能的差异的方法是:
[0042]根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果进行判定，若能将玉米芯木聚糖中木寡糖在2min之内迅速转化成木糖的即鉴定该木聚糖酶含有β-木糖苷酶;若能将玉米芯木聚糖中木聚糖在2min之内迅速降解为木寡糖，而木寡糖在240min内被缓慢降解为木糖及短寡糖的即鉴定该木聚糖酶含有内切木聚糖酶;若在玉米芯木聚糖酶解产物中检测到带有甲基化葡萄糖醛酸侧链的木三糖并且其含量随时间序列反应逐渐增加后趋于稳定的即鉴定该木聚糖酶归于CAZy数据库(http: //www.cazy.0rg/)中糖苷水解酶1家族的木聚糖酶;若在玉米芯木聚糖酶