一种制备灵芝胞外多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种制备灵芝胞外多糖的方法，具体涉及一种微生物液态深层培养过程中提高胞外多糖产量的发酵工艺。
【背景技术】
[0002]灵芝(Ganoderma Lucidum)别名“瑞芝”、“仙草”，是一种药食两用的真菌，在我国灵芝入药已有两千多年的历史。灵芝中含有多种生物活性成分，如多糖、三萜类化合物、核苷类、生物碱类和留醇类等，具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化和清除自由基的作用，且对于慢性支气管炎、冠心病、糖尿病、神经衰弱等疾病都有一定的疗效。灵芝多糖是灵芝主要的活性成分之一，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、消除体内自由基、抗氧化、抗衰老、保肝护肝、利胆清热、活血化瘀等功效。
[0003]灵芝多糖的来源主要有两种:人工栽培的灵芝子实体和孢子粉、液态发酵的灵芝菌丝体。液态发酵灵芝菌丝体与人工栽培灵芝相比，具有周期短、产量大、产品质量稳定等特点，且通过液体深层发酵培养灵芝菌丝体，所得的产品苦味小，营养价值及有效成分不低于子实体甚至有些指标高于子实体，其中菌丝体中的粗多糖及多糖含量均高于子实体。因此，灵芝液态发酵是目前国内外应用的一种工业化生产灵芝多糖的方法。近年来，灵芝液态发酵的研究取得了很大的进展，但如何更进一步的提高灵芝多糖的产量，降低生产成本，提高经济效益，成为一个亟待解决的问题。
[0004]可通过两种方法提高灵芝多糖的产量:一是对发酵培养基及发酵过程进行优化，不同的培养基配方和培养条件能够影响菌丝体生长和活性成分如胞外多糖的积累。适当的碳源、氮源、无机盐离子和生长因子种类和浓度，合适的培养基配比以及初始PH值均有利于灵芝菌丝体的发酵和多糖的合成;二是在培养基中添加外源物质来促进胞外多糖的合成，提高胞外多糖的产量。如Hailong Yang等(Stimulatory effects of Coix lacryma-jobioil on the mycelial growth and metabolites b1synthesis by thesubmergedculture of Ganoderma Iucidum.B1chemical Engineering Journal76(2013)77_82)石开究表明在发酵培养基中添加2%的薏米油，胞外多糖产量是未添加薏米油时的2.2倍;谭才邓等(灵芝液体发酵产胞内多糖的培养基优化.现代食品科技，2013，29(3): 549-552.)研究发现维生素&对灵芝菌丝生长与多糖含量影响较大，且维生素B1的最佳使用浓度为0.1 %，此时菌丝生物量和多糖产量均达到最高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种制备灵芝胞外多糖的方法。
[0006]本发明提供的制备灵芝胞外多糖的方法，包括如下步骤:
[0007]将灵芝菌种接种于发酵培养基中，培养；
[0008]所述发酵培养基由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
[0009]所述碳源具体可为葡萄糖。
[0010]所述氮源具体可为酵母粉。
[0011]所述无机盐具体可为镁盐和钾盐。所述镁盐具体可为MgSO4和/或水合MgSO4。所述钾盐具体可为KH2PO4和/或水合KH2P04。所述水合MgSO4具体可为MgSO4.7H20。
[0012]所述提供木质素的原料具体可为汉麻杆粉或栎木粉。
[0013]所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.0-4.0%，酵母粉的质量百分含量可为I.0-3.0%，镁盐的质量百分含量可为0.05-0.2%，钾盐的质量百分含量可为0.Ι-Ο.3%, 汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为0.5-5.0%。
[0014]所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.5-3.0%，酵母粉的质量百分含量可为1.5%，镁盐的质量百分含量可为0.1%，钾盐的质量百分含量可为0.2%，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为1.0-3.0%。
[0015]所述发酵培养基具体可为如下(I)至(VI)中的任意一种:
[0016](I):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%、MgS04.7H2O的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为1.0%，余量为水；
[0017](Π):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为2.0%，余量为水；
[0018](m):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为3.0%，余量为水；
[0019](IV):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1%、KH2P04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0%，余量为水；
[0020](V):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7Η20的质量百分含量为0.1%、ΚΗ2Ρ04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为2.0%，余量为水；
[0021](VI):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%、MgS04.7H20的质量百分含量为0.1%、KH2P04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为3.0%，余量为水；
[0022](VH):葡萄糖的质量百分含量为2.5%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7Η20的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为1.0%，余量为水；
[0023](Μ):葡萄糖的质量百分含量为2.5%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7Η20的质量百分含量为0.1%、ΚΗ2Ρ04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0%，余量为水。
[0024]所述培养的条件可为:25-300C、130-180rpm振荡培养4-7天。
[0025]所述培养的条件具体可为:280C、ISOrpm振荡培养5天。
[0026]所述方法还包括如下步骤:完成所述培养后，收集液相，进行乙醇沉淀并收集沉淀。所述乙醇沉淀的方法具体可为:将I体积份所述液相与4体积份95% (质量百分含量)乙醇水溶液混合，然后4°C静置12小时。
[0027]所述收集沉淀的方法具体可为:1000rpm离心20min。
[0028]所述方法中，所述“将灵芝菌种接种于发酵培养基中”指的是将种子液接种于发酵培养基中。所述种子液的制备方法为:将灵芝菌种接种至种子培养基，28°C，180rpm振荡培养，得到菌浓度为3-4mg/mL的种子液(3_4mg指的是菌体干重)。种子培养基(pH6.0):葡萄糖208/1、酵母粉5.(^/1、1012?041.(^/1、1%304.7H20 1.0g/L，余量为水。所述方法中，具体将15mL所述种子液接种至135mL所述发酵培养基。
[0029]本发明还保护一种用于制备灵芝胞外多糖的发酵培养基，由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
[0030]所述碳源具体可为葡萄糖。
[0031 ]所述氮源具体可为酵母粉。
[0032]所述无机盐具体可为镁盐和钾盐。所述镁盐具体可为MgSO4和/或水合MgS04。所述钾盐具体可为KH2PO4和/或水合KH2P04。所述水合MgSO4具体可为MgSO4.7H20。
[0033]所述提供木质素的原料具体可为汉麻杆粉或栎木粉。
[0034]所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.0-4.0%，酵母粉的质量百分含量可为I.0-3.0%，镁盐的质量百分含量可为0.05-0.2%，钾盐的质量百分含量可为0.Ι-Ο.3%, 汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为0.5-5.0%。
[0035]所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.5-3.0%，酵母粉的质量百分含量可为1.5%，镁盐的质量百分含量可为0.1%，钾盐的质量百分含量可为0.2%，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为1.0-3.0%。
[0036]所述发酵培养基具体可为如下(I)至(VI)中的任意一种:
[0037](I):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%、MgS04.7H2O的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为1.0%，余量为水；
[0038](Π):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为2.0%，余量为水；
[0039](m):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1 %、1(!12?04的质量百分含量为0.2%、栎木粉的质量百分含量为3.0%，余量为水；
[0040](IV):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%,MgSO4.7H20的质量百分含量为0.1%、KH2P04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0%，余量为水；
[0041 ] (V):葡萄糖的质量百分含量为3.0%、酵母粉的质量百分含量为1.5%、MgS04.7H20的质量百分含量为0.1%、KH2P04的质量百分含量为0.2%、汉麻杆粉的质量百分含量为2.0%，余量为水；
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