专利名称：一种检测灵芝产品质量的方法
技术领域：
本发明属中药领域，涉及检测中药产品质量的方法，具体涉及一种检测灵芝产品质量的方法。
背景技术：
灵芝是中医药用药历史较长的中药之一，两千年前东汉时期的《神农本草经》中将灵芝列为上品，认为“久食，轻身不老，延年神仙”。明朝李时珍编著的《本草纲目》中记载灵芝味苦、平，无毒，益心气，活血，入心充血，助心充脉，安神，益肺气，补肝气，补中，增智慧，好颜色，利关节，坚筋骨，祛痰，健胃。
现代医学证明灵芝含有多种生理活性物质，能够调节、增强人体免疫力，对神经衰弱、风湿性关节炎、冠心病、高血压、肝炎、糖尿病、肿瘤等有良好的协同治疗作用，已有研究表明其中的灵芝多糖肽可通过抑制肿瘤新生血管的形成及抑制癌细胞的侵袭而抑制肿瘤的生长(CN200410014681.3)。最新研究表明灵芝还具有抗疲劳，美容养颜，延缓衰老，防治爱滋病等功效。故，芝多糖肽被同业认同为灵芝类产品质量检测的重要标准之一。
目前，市场上灵芝产品繁多，质量良莠不齐。双灵固本(商品名)口服制剂是在中医药理论的基础指导下，研制成的含有灵芝多糖肽成分的口服制剂。经临床观察证明具滋补强身，扶正固本的功效。对消化道肿瘤及术后，放、化疗引起的体弱，厌食，失眠等症有较好的康复保健作用。为保持双灵固本口服制剂其临床恒定的有效性，必须进行质量监控。通常采用的检测手段存在较繁琐，周期长灵敏度低等缺陷，目前尚缺少一种能有效检测灵芝产品中活性成分灵芝多糖肽的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测灵芝产品质量的方法，具体涉及一种以牛血清白蛋白为对照品对灵芝类产品中灵芝多糖肽成分的含量的测定方法。
研究证实灵芝多糖肽是灵芝起主要药理作用的成分之一，本发明方法克服了现有技术的缺陷，能有效地测得灵芝及灵芝产品中多糖肽的肽的含量，并能克服灵芝多糖及植物中脂类物质的干挠，检测灵敏高、重复性好，有利于灵芝及灵芝产品制剂质量的调控及其疗效的发挥及对产品生产工艺、贮藏期质量的控制。
本发明采用双灵固本口服制剂为测试产品，其内含生理活性物质灵芝多糖肽，所述的灵芝多糖肽是由6-7种单糖和5-20个氨基酸组成的糖肽，可从灵芝(Ganogerma lucidum)提取而得，已有实验证实所述的多糖蛋白GL-PP(申请号200410014681.3)具有较强药理活性的成分。所述的双灵固本口服制剂通过下述方法制备取灵芝孢子，经超音速喷雾负压低温干燥法破壁，备用。取灵芝粉碎成粗粉，加乙醇，加热回流提取3次，滤过(药渣备用)，合并滤液，减压回收乙醇，并浓缩成浸膏，备用；药渣加水煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩成浸膏，备用；合并上述两种浸膏，加水稀释成清膏，喷雾干燥，加入上述破壁的灵芝孢子，混匀，制成口服制剂。
本发明依据双灵固本口服制剂内容物的特征，以牛血清白蛋白为对照品，采用蛋白质测定法(Folin-酚试剂法)对制剂中灵芝多糖肽成分进行含量测定。
本发明利用多糖蛋白GL-PP其氨基酸肽类物质的共性，即蛋白质含有两个以上的肽键(-CO-NH-)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物；Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，和/或蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，在碱性条件下不稳定，生成蓝色化合物(钼蓝)的原理，通过比色便可测知产品样本中的肽类含量。本方法经对双灵固本口服制剂测定，突出体现出操作简便、灵敏度高、且不受溶液中多糖干扰的优点。
本发明技术方案通过如下步骤实现(1)制备肽对照品溶液取牛血清白蛋白(市购)对照品加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得；(2)制备测试品溶液 A法取双灵固本口服制剂1g，精密称定，加水溶解制成每1ml中含0.6mg的溶液，过滤，备用；B法取供试品1g，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加热10分钟，超声10分钟，放冷，过滤，取滤液4ml，加无水乙醇12ml，搅拌，以10000rpm离心10分钟，弃去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得；
(3)碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液，临用前，合并两液，并加水至500ml；福林酚试液 取2mol/L市售福林酚贮备液，按1∶16比例稀释，即得；(4)制备标准曲线 精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以0管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在750nm波长处测定吸收度，以牛血清白蛋白的量与其对应的吸收度计算回归方程。
(5)测定 精密量取测试品溶液1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温；以标准曲线0管为空白，在750nm波长处测定吸收度，由回归方程计算，即得；按干燥品计算，其中含肽量以牛血清白蛋白计不得少于3.0％。
本发明对上述灵芝多糖肽含量测定的方法进行了验证a.最大吸收波长的选择精密量取对照品溶液和供试品液各0.5ml，分别置于具塞试管中，加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以蒸馏水2ml同上操作制做空白溶液，在400～800nm波长范围内扫描。扫描结果显示牛血清白蛋白对照品和供试品的入max均为750nm。说明此波长对肽类物质测定具有共性，对被测物有一定的选择性和代表性。表1是供试品和对照品400~800nm的吸收情况表1
b.显色的稳定性依照选择的最大吸收波长对供试品溶液及对照品溶液测定方法及在入max处对供试品及对照品的显色稳定性验证结果表明，样品在1-3小时内可测定出结果。表2是显色稳定性验证结果。
表2
c.标准曲线制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以0管为空白，照分光光度法，在750nm波长处测定吸收度。以牛血清白蛋白的量与其对应的吸收度计算回归方程。结果表明，牛血清白蛋白吸收强度在62.8～314ug范围内，线性关系良好。表3是线性关系结果。
表3
d.精密度精密量取对照品溶液0.6ml，取6份照标准曲线方法测定，结果表明，精密度良好。表4是精密度测定结果。
表4
e.重复性以双灵固本口服制剂批号为040601供试品，照供试品溶液制备法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1ml，共6份，照标准曲线方法测定，表5是重复性测定结果。
表5
f.回收率试验取已知含量的样品1g，共计称得5份，于每份样本中加入0.2ml对照品溶液，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加热10分钟，超声10分钟，放冷，过滤，取滤液4ml，加无水乙醇12ml，搅拌，以10000rpm离心10分钟，弃去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml。分别各加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以0管为空白，照分光光度法，在750nm波长处测定吸收度，结果表明牛血清白蛋白回收率达100.04％，RSD％为1.33％，方法准确性良好。。表6是回收率试验结果。
表6
图1是选择最大吸收波长图。
图2是牛血清白蛋白吸收强度线性关系图。
具体实施例方式
实施例1采用以牛血清白蛋白为对照品对双灵固本口服制剂中灵芝多糖肽成分进行含量测定。
制备肽对照品溶液取牛血清白蛋白对照品加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
分别配制下述溶液①供试品溶液A法取本品1g，精密称定，加水溶解制成每1ml中含0.6mg的溶液，过滤，备用；B法取供试品1g，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加热10分钟，超声10分钟，放冷，过滤，取滤液4ml，加无水乙醇12ml，搅拌，以10000rpm离心10分钟，弃去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得。
②碱性铜试液 取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并两液，并加水至500ml。
③福林酚试液 取2mol/L市售福林酚贮备液，按1∶16比例稀释，即得。
制备标准曲线精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以0管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在750nm波长处测定吸收度。以牛血清白蛋白的量与其对应的吸收度计算回归方程。
测定分别对各剂型双灵固本口服制剂样品灵芝多糖肽中肽的含量进行测定，精密量取供试品溶液1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以标准曲线0管为空白，在750nm波长处测定吸收度，由回归方程计算，即得。按干燥品计算，含肽以牛血清白蛋白计算其样品的含量％值。
表7本发明检测方法对各剂型双灵固本口服制剂检测结果。
表7
权利要求
1.一种检测灵芝产品质量的方法，特征在于采用以牛血清白蛋白为对照品，对灵芝产品中灵芝多糖肽进行含量测定，包括如下步骤(1)制备肽对照品溶液；(2)制备测试品溶液；(3)配制碱性铜试液和福林酚试液；(4)制备标准曲线；(5)含肽量测定。
2.如权利要求1所述的检测灵芝产品质量的方法，其中所述的灵芝产品是双灵固本口服制剂，包括双灵固本片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂和软胶囊剂。
3.如权利要求1所述的检测灵芝产品质量的方法，其特征在于所述的对照品溶液其中每1ml含0.3mg牛血清白蛋白。
4.如权利要求1所述的检测灵芝产品质量的方法，其特征在于所述的测试品溶液通过A法制备取双灵固本口服制剂1g，加水溶解成每1ml含0.6mg所述制剂的溶液，过滤，备用；或通过B法制备取供试品1g，加水制成每1ml含10mg的溶液，60℃水浴加热10分钟，超声10分钟，放冷，过滤，取滤液4ml，加无水乙醇12ml，搅拌，10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得。
5.如权利要求1所述的检测灵芝产品质量的方法，其特征在于所述的碱性铜试液通过下述方法制备取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，为乙液，用前，合并两液，并加水至500ml。
6.如权利要求1所述的检测灵芝产品质量的方法，其特征在于所述的福林酚试液是将2mol/L福林酚贮备液，按1∶16稀释制得。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及检测中药产品质量的方法，具体涉及一种检测灵芝产品质量的方法。本发明以牛血清白蛋白为对照品对双灵固本口服制剂中灵芝多糖肽成分的含量测定。本发明方法克服了现有技术的缺陷，能有效地测得灵芝及灵芝产品中多糖肽的肽的含量，并能克服灵芝多糖及植物中脂类物质的干挠，检测灵敏高、重复性好，有利于灵芝及灵芝产品制剂质量的调控及其疗效的发挥及对产品生产工艺、贮藏期质量的控制。
文档编号A61P1/00GK1939351SQ20051003027
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者林树钱, 林志彬, 刘梅英, 李宝棣, 王赛贞, 刘斌, 曹琦珍, 王峰, 吴云鸣 申请人:西安绿谷制药有限公司, 福州绿谷生物药业技术研究所