专利名称：秋水仙碱及它的衍生物的医学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物碱及它的衍生物的医学用途，更具体指从秋水仙属植物中提取秋水仙碱及它的衍生物。
背景技术：
秋水仙碱(colchicine)又名秋水仙素，COLC，Colchineos，Colcin，Colgout，Aquacolchin，NSC-757.是从百合科秋水仙属植物秋水仙球茎和种子等或从百合科植物，滇产山慈菇及中国水仙中提取的一种生物碱。学名N-((7S)-5，6，7，9-tetrahydro-1，2，3，10-tetramethoxy-9-oxobenzo(a)heptalen-7-yl-acetamide，结构式为C22H25NO6，分子量为399.44Dolton其化学机构见下图 秋水仙碱早在1820年已被分离(Pelletier PS，Caventon J.Ann.Chim.Phys.1820；1469)，最初被用于治疗痛风，后被发现秋水仙碱可以结合在细胞内的管状蛋白，抑制细胞的有丝分裂。以后，人们发现秋水仙碱可抑制血液中性粒细胞的游离，具有减轻炎症反应疗效。
秋水仙碱30年代就作为染色体研究的工具药。据已有文献描述，秋水仙碱及其衍生物可作用于细胞周期的M期，抑制细胞有丝分裂，导致细胞核结构异常而引起细胞死亡。分裂旺盛的组织细胞最先受到影响。秋水仙碱这一药理活性被用于治疗肿瘤。在体外肿瘤细胞模型上，秋水仙碱抑制细胞生长的浓度为0.5-1.3μM(0.2μg-0.6μg/ml)(参照Reduction in S100 protein βsubunit RNA in C6 rat glioma cells followingtreatment with anti-microtubular drugs.Robert Dunn，Charles Landry，David O’Hanlon，James Dunn，Robert Allore，Ian Brown and Alexander Marks.The Journal of BiologicalChemistry.1987，262(8)3562-3566)。实验小鼠肿瘤模型上秋水仙碱抑制肿瘤的剂量为每天1mg/kg(参照Evaluation of antivascular and antitumor effects of tubulin bindingagents in solid tumor therapy.Yukio Nihei，Manabu Suzuki，Akira Okano，Takashi Tsuji，Yukio Akiyama，Takashi Tsuruo，Sachiko Saito，Katsuyoshi Hori and Yasufumi Sato.Jpn.J.Cancer Res.1999，901387-1395)。
目前，秋水仙碱及其衍生物在临床上被用于治疗肿瘤和白血病，也用于治疗急性痛风性关节炎，Cystic Fibrosis等疾病。其治疗剂量为静滴，每次1-2mg，静脉注射每次1mg，每日一次。口服每次1mg。秋水仙碱衍生物秋裂胺或复方秋裂胺静滴每日一次10mg，口服每次5mg，每日4次。不良反应为口服给药可引起腹痛，腹泻，恶心呕吐等胃肠道反应。长期口服或静脉用药可引起白细胞及血小板减少，骨髓抑制及再生障碍性贫血，呼吸中枢抑制(参照现代临床药物大典，罗明生，高天惠，劳家华主编，2001年1月第一版，四川科学技术出版社，268-269页；中华内科学，陈敏章主编，人民卫生出版社，1999年第一版，3332-3333页；现代肿瘤治疗药物学，廖子君，南克俊，韩军主编，世界图书出版社西安公司，2002年第一版，272-274页)。
发明内容
本发明的目的是提供一种水仙碱及它的衍生物新医学用途。
本发明阐述秋水仙碱及它的衍生物的药理活性及作用机理。即促进血液纤维蛋白溶解系统活性升高而促进血栓溶解，从而阐明秋水仙碱及其衍生物可用于治疗以及预防因血管内血栓形成或栓塞而引起的各种疾病。
人体内血管，包括各种大小直径的动脉，静脉和毛细血管在正常生理状态下，管腔开放，血流通畅，以此保证人体各部位脏器的营养和氧气供应，维持各部位脏器正常功能运作。人体血液中具备一种凝血机制，一旦血管壁出现破损，血液凝血系统活化，最终导致可溶性的纤维蛋白原(fibrinogen)在凝血酶(thrombin)作用下转化为互相交连网络状的纤维蛋白(fibrin)，在局部发生血液凝固。此生理保护机制可防止血液流失过多，并有助于血管壁的修复。但是在病理情况下，血管壁，尤其是直接与血液接触的内皮细胞层，可因各种因素出现异常，也会激活血液中已含有的凝血因子和血小板。其结果造成纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并沉积在血管壁上，从而形成固体病理血栓，引起病变部位的血管狭窄，甚至完全堵塞。在血管中，尤其是静脉中形成的血栓，还可以脱落后随血流行走，引起远端小管腔的血管堵塞，形成突发性栓塞。无论是原位血栓的形成，或是远端突发性栓塞均可导致存在血栓部位的组织脏器血供受堵，细胞死亡，功能衰退，发生梗死。由此引发的临床较典型的疾病有心肌梗塞，深静脉血栓，和脑梗死等。
血液凝固后在正常情况下可通过纤维蛋白溶解机制加以清除，以保证组织修复。由参与纤维蛋白溶解的各种成分组成的纤维蛋白溶解系统简称为纤溶系统。其中最重要的成分为组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)。t-PA是由血管内皮细胞受刺激后释放到血液中的丝氨酸蛋白酶，t-PA释放量控制了溶解由纤维蛋白组成的血栓凝块的速度。t-PA具有高度亲和纤维蛋白，而非纤维蛋白原的生物特性，此特性保证了其作用有高度局部性和特异性。吸附在纤维蛋白上的t-PA通过转化同样吸附在纤维蛋白上的纤溶酶原(plasminogen)成为纤溶酶(plasmin)，由纤溶酶切割血栓，使互相交连的纤维蛋白逐渐水解断裂，从而清除血栓(参照血栓病临床新技术。王鸿利，王学锋主编，2003年1月第1版，人民军医出版社)。
因此，血栓性疾病可由病理性的促进凝血因素长期存在，过强，或者是人体的纤溶系统活性过弱所引起。因此，目前临床上使用于治疗血栓性疾病的药物分为二种，一种通过抑制血液凝固活性以及抗血小板聚集，减缓血栓形成的速度，代表药物有肝素，维他命K抑制剂和阿司匹林等。另一类药物为促纤溶性药物，通过注射大量纤溶酶原激活物，活化纤溶酶，以达到快速溶栓的疗效。代表药物有重组蛋白t-PA。其它替代药物有链激酶和尿激酶。它们同样是生物蛋白制品，通过活化纤溶酶原，达到溶解血栓的目的。前一类药物一般可长期使用，控制血栓发生和生长，而后一类药物一般在血栓引起致命性组织梗死时短时间内监护使用，达到抢救病人生命的目的。
本发明说明，秋水仙碱及其衍生物能够在低浓度的条件下，显著提高血管内皮细胞释放人体t-PA，从而促进血栓溶解加快，因此，秋水仙碱及其衍生物可用于治疗由血栓栓塞引起的各种疾病。
本发明是这样实施的材料与方法1.RT-PCR方法测定内皮细胞系组织纤溶酶原激活物的表达人微血管内皮细胞系HMEC-1培养在含加10％小牛血清的MCDB131培养液的平皿内48小时后，分别加入5ng/ml；2.5ng/ml和0.5ng/ml的秋水仙碱(Sigma公司)，孵育18小时，用胰蛋白酶脱下细胞，用磷酸缓冲液离心洗净，提取细胞内总RNA。用以下引物做RT-PCR测定组织纤溶酶原激活物的表达引物15′-GTGTACACCAAGGTTACCAA-3′引物25′-GGAATACCTTCTGAGAGCCA-3′用以下引物做RT-PCR测定尿激酶的表达
引物15′-TCAAGTTCCATCGAACTGTG-3′引物25′-ATCAATGAAGCAGTGTGTGG-3′以上引物从Invitrogen公司定购。
2.免疫酶标法(ELISA)测定内皮细胞系组织纤溶酶原激活物的分泌秋水仙碱人微血管内皮细胞系HMEC-1培养在含加10％小牛血清的MCDB131培养液的平皿内48小时后，分别加入50ng/ml；10ng/ml；5ng/ml；1ng/ml和0.5ng/ml的秋水仙碱，孵育24小时，收集上清液。用免疫酶标法(American Diagnostic公司的试剂盒)测定上清液样品中组织纤溶酶原激活物的浓度。细胞用胰蛋白酶脱下计数。秋水仙碱衍生物人微血管内皮细胞系HMEC-1培养在含加10％小牛血清的MCDB131培养液的平皿内48小时后，分别加入10ng/ml；5ng/ml；2.5ng/ml和1ng/ml的秋水仙胺(Demecolcine，ICN公司)，孵育24小时，收集上清液。用免疫酶标法(AmericanDiagnostic公司的试剂盒)测定上清液样品中组织纤溶酶原激活物的浓度。细胞用胰蛋白酶脱下计数。
3.实验动物血浆中组织纤溶酶原激活物活性的测定。
42只八周大的雌性C57BL/6小鼠随机分为7组，每组6只小鼠。分别接受腹腔注射秋水仙碱(溶于生理盐水)40μg/kg；16μg/kg；6.5μg/kg；2.5μg/kg；1μg/kg和0.1μg/kg。对照小鼠接受生理盐水注射。24小时后抽取血样，用3.8％枸橼酸钠抗凝全血，离心(2500xg，10分钟)，分离贫血小板血浆。血浆中t-PA活性浓度采用小鼠组织纤溶酶原激活物活性免疫酶标法测定试剂盒(mouse t-PA activity ELISA assay kit)(Gentaur公司)进行测定。由于96孔板上包埋的是纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)，只有游离的有活性的t-PA才可能结合在板上，故而测出的是t-PA活性浓度。
4.优球蛋白法测定实验动物血浆中组织纤溶酶原激活物活性25只十六周大的雌性裸鼠随机分为5组，每组5只小鼠。分别接受腹腔注射秋水仙碱(溶于生理盐水)40μg/kg；16μg/kg；2.5μg/kg和0.1μg/kg。对照小鼠接受生理盐水注射。15小时后由心脏抽取约1ml血样，用3.8％枸橼酸钠抗凝全血，离心(2500xg，10分钟)，分离贫血小板血浆。采取优球蛋白溶解时间测定法来测定血浆中组织纤溶酶原激活物活性(方法参照现代药理实验方法。张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年第一版，1201页)。
5.实验动物肺栓塞模型栓溶观察(参照Stassen JM等人的方法Stassen JM，Vanlinthout I，Lijnen HR and Collen D.A hamster pulmonary embolism model for thecvaluaton of the thrombolytic and pharmacokinetic properties of thrombolytic agents.Fibrinolysis，1990 suppl 2，415-21以及Carmeliet P等对此方法的改进Adenovirus-mediated transfer of tissue-type plasminogen activator augments thrombolysis in tissue-typeplasminogen activater-deficient and plasminogen activator-1-overexpressing mice.Blood，1997，90(4)1527-1534)。
125I标记的纤维蛋白血浆凝块的制备用125I标记的纤维蛋白原，3.8％枸橼酸钠抗凝制备的小鼠贫血小板血浆(同上)，以及凝血酶和CaCl2进行混合制成。
21只十周大的雌性裸鼠随机分为3组，每组7只小鼠。用药组小鼠分别接受腹腔注射秋水仙碱(溶于生理盐水)16μg/kg和2.5μg/kg，对照组小鼠接受生理盐水注射。12小时后，实施小鼠麻醉，将25μl的125I标记的纤维蛋白血浆凝块(含有约70000cpm的125I标记的人纤维蛋白原与鼠血浆混和制成)通过颈静脉注射进入体内形成肺栓塞。注射血浆凝块1小时后，将gamma计数器探头置于上胸腔部位进行肺部同位素检测，作为栓溶前参照。实验过程中连续检测栓溶情况。16小时后处死小鼠，检测心脏和肺部残留的同位素含量。消失的同位素量对比注射的同位素量作为栓溶百分比。
6.秋水仙碱对实验动物的毒性观察24只七周大的雌性裸鼠随机分为3组，每组8只小鼠。两组小鼠分别接受每天腹腔注射秋水仙碱40μg/kg和16μg/kg，连续30天。对照组小鼠接受每天腹腔注射生理盐水，连续30天。每两天称一次体重。
实验结果1.RT-PCR实验结果表明，5ng/ml和2.5ng/ml秋水仙碱可以显著增加内皮细胞组织纤溶酶原激活物(t-PA)的表达(图1)。在同样条件下，尿激酶(u-PA)的表达不受影响(图2)。
2.免疫酶标法实验结果表明，50ng/ml，10ng/ml，5ng/ml和1ng/ml秋水仙碱可以显著增加内皮细胞组织纤溶酶原激活物(t-PA)的分泌(图3A)。另外，实验中观察到所用秋水仙碱剂量对内皮细胞无明显毒性。10ng/ml；5ng/ml和2.5ng/ml秋水仙胺也可以显著增加内皮细胞组织纤溶酶原激活物(t-PA)的分泌(图3B)。
3.秋水仙碱显著增强实验动物血浆中组织纤溶酶原激活物活性。腹腔注射6.5μg/kg和2.5μg/kg秋水仙碱可在24小时内使组织纤溶酶原激活物活性浓度分别增加12倍和16.8倍(图4)。优球蛋白溶解时间测定法结果显示腹腔注射40μg/kg，16μg/kg；2.5μg/kg和0.1μg/kg秋水仙碱15小时后血浆优球蛋白完全溶解时间分别为108±5分钟，55±4分钟，37±4分钟和110±6分钟，而对照组为128±5分钟。
表1
4.秋水仙碱加速实验动物肺栓塞溶解。腹腔注射秋水仙碱16μg/kg和2.5μg/kg可在16小时后分别引起65％±7和87％±8的肺栓塞溶解。对照组动物肺栓塞溶解为32％±7(图5)。
5.连续30天每天腹腔注射秋水仙碱40μg/kg和16μg/kg未引起出血，体重减轻，脱毛及食欲减退等毒性反应。连续注射第30天，对照组小鼠平均体重为26.9±1.2g；注射秋水仙碱40μg/kg组为26.4±1.3g；注射秋水仙碱16μg/kg组为27.1±0.9g(表1)。
实验结果表明，秋水仙碱及其衍生物在相当低的浓度范围内可以显著增强组织纤溶酶原激活物(t-PA)的表达和分泌，从而促进纤溶活性。而在同样条件下，尿激酶(u-PA)的表达不受影响。因此微小剂量秋水仙碱可用于所有血栓性疾病的治疗及预防。
秋水仙碱及衍生物或其药学上可接受的盐以药物组合物的形式或单独或与药物学上可接受的载体或赋形剂，组成组合物，组合物其中包括但不限于小剂量的阿司匹林，Reopro等组成的组合物。药学上可接受的载体指的是一种或多种相容性固体或液体填充剂或赋形剂，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效，医学上可接受的载体部分例子有糖(如葡萄糖、蔗糖、乳糖等)淀粉(如玉米淀粉、马铃薯淀粉等)纤维素及其共衍生物(如羧甲醛纤维素纳、乙醛纤维素纳、纤维素乙酸酯、微品纤微素)聚乙二醇、明胶、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙，植物油(豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)。还可以是氯化剂(如吐温)润湿剂(如十二烷硫酸纳)。本发明的组合物的载体的选择取决于化合物的给药方式。
图1是RT-PCR测定内皮细胞组织纤溶酶原激活物表达结果。
细胞分别用5ng/ml；2.5ng/ml和0.5ng/ml的秋水仙碱处理18小时后，提取RNA。用t-PA特异引物做RT-PCR。RT-PCR产物经过琼脂板电泳，拍照，组织纤溶酶原激活物表达情况如图1所示。
图2是RT-PCR测定内皮细胞尿激酶表达结果。
细胞分别用5ng/ml；2.5ng/ml和0.5ng/ml的秋水仙碱处理18小时后，提取RNA。用尿激酶特异引物做RT-PCR。RT-PCR产物经过琼脂板电泳，拍照，尿激酶表达情况如图2所示。
图3是免疫酶标法测定内皮细胞组织纤溶酶原激活物分泌结果。
细胞分别用50ng/ml；10ng/ml；5ng/ml；1ng/ml和0.5ng/ml的秋水仙碱处理24小时后，收集上清液，用免疫酶标法测定组织纤溶酶原激活物的分泌。计数细胞。组织纤溶酶原激活物的浓度以每106个细胞的t-PA分泌量表达于图3A中。
细胞分别用10ng/ml；5ng/ml；2.5ng/ml；1ng/ml的秋水仙胺处理24小时后，收集上清液，用免疫酶标法测定组织纤溶酶原激活物的分泌。计数细胞。组织纤溶酶原激活物的浓度以每106个细胞的t-PA分泌量表达于图3B中。
图4是免疫酶标法测定实验小鼠血浆中组织纤溶酶原激活物活性浓度的结果。
实验小鼠分别接受腹腔注射秋水仙碱(溶于生理盐水)40μg/kg；16μg/kg；6.5μg/kg；2.5μg/kg；1μg/kg和0.1μg/kg。24小时后抽取血样，用3.8％枸橼酸钠抗凝全血，离心分离血浆。血浆中t-PA活性采用小鼠组织纤溶酶原激活物活性免疫酶标法测定试剂盒(mouse t-PA activity ELISA assay kit)(Gentaur公司)进行测定。所得活性浓度结果表现在图4中。
图5是同位素标记体内肺栓塞溶解的结果。小鼠先分别接受腹腔注射秋水仙碱(溶于生理盐水)16μg/kg和2.5μg/kg。然后麻醉小鼠，将125I标记的纤维蛋白血浆凝块通过颈静脉注射进入体内形成肺动脉栓塞。16小时后处死小鼠，检测心脏和肺部残留的同位素含量。结果换算成栓溶百分比后表达于图5中。
表1是秋水仙碱对实验动物的毒性观察结果。
实验小鼠随机分为3组，每组8只小鼠。两组小鼠分别接受每天腹腔注射秋水仙碱40μg/kg和16μg/kg，连续30天。对照组小鼠接受每天腹腔注射生理盐水。每两天称一次体重，结果列入表1。
具体实施例方式
实施例125只十六周大的雌性裸鼠体重约28克，随机分为5组，每组5只小鼠。第一组小鼠接受1次性腹腔注射40μg/kg秋水仙碱(200μl，溶于生理盐水，浓度为5.6μg/ml)。第二组小鼠接受1次性腹腔注射16μg/kg秋水仙碱(200μl，溶于生理盐水，浓度为2.24μg/ml)。第三组小鼠接受1次性腹腔注射2.5μg/kg秋水仙碱(200μl，溶于生理盐水，浓度为0.35μg/ml)。第四组小鼠接受1次性腹腔注射0.1μg/kg秋水仙碱(200μl，溶于生理盐水，浓度为0.014μg/ml)。第五组对照小鼠接受1次性腹腔注射200μl生理盐水。注射15小时后用Isofluran麻醉小鼠，由心脏抽取约1ml血样，置入含有100μl3.8％枸橼酸钠的1.5ml eppendorf离心管中，混匀，室温离心(2500xg，10分钟)，分离贫血小板血浆，约各得0.55ml血浆。取0.5ml血浆，采取优球蛋白溶解时间测定法来测定血浆中组织纤溶酶原激活物活性。具体操作完全按照张均田主编的″现代药理实验方法″1201页所述进行。实验结果显示腹腔注射40μg/kg；16μg/kg；2.5μg/kg和0.1μg/kg秋水仙碱15小时后各组小鼠血浆优球蛋白完全溶解时间平均分别为108±5分钟，55±4分钟，37±4分钟和110±6分钟，而对照组为128±5分钟。
实施例23.8％枸橼酸钠抗凝制备的混和小鼠贫血小板血浆将2只八周大的雌性裸鼠用Isofluran麻醉，由心脏抽取约1ml血样，置入含有100μl 3.8％枸橼酸钠的1.5mleppendorf离心管中，混匀，室温离心(2500xg，10分钟)，分离贫血小板血浆，将所得的2只小鼠的血浆混和均匀备用。
125I标记的人纤维蛋白原由Amersham公司提供，用生理盐水稀释至70000cpm/μl。
125I标记的纤维蛋白血浆凝块的制备在0.5ml的eppendorf管中分别加入21μl上述小鼠血浆，1μl 70000cpm的125I标记的人纤维蛋白原，以及0.5μl的0.07UI/μl的凝血酶和2.4μl的1M CaCl2进行混合，并立即吸入到6FG的导管内，置于37℃孵育30分钟，待凝块形成后室温放置备用。
21只十周大的雌性裸鼠体重约20克，随机分为3组，每组7只小鼠。第一组小鼠接受一次性腹腔注射16μg/kg秋水仙碱(200μl，溶于生理盐水，浓度为1.6μg/ml)，第二组小鼠接受一次性腹腔注射秋水仙碱2.5μg/kg(200μl，溶于生理盐水，浓度为0.25μg/ml)，第三组对照小鼠接受一次性200μl生理盐水腹腔注射。12小时后将小鼠麻醉，将颈静脉暴露，将含有25μl的125I标记的纤维蛋白血浆凝块的导管引入颈静脉内，将栓塞注射进入体内形成肺栓塞。然后换导管注射0.1ml(300U/ml)的肝素溶液。注射血浆凝块1小时后，将gamma计数器探头置于上胸腔部位进行肺部同位素检测，作为栓溶前参照。16小时后处死小鼠，检测心脏和肺部残留的同位素含量。消失的同位素量对比注射的同位素量作为栓溶百分比。实验结果见图5。
实施例342只八周大的雌性C57BL/6小鼠体重约18克，随机分为7组，每组6只小鼠。分别接受一次性腹腔注射200μl秋水仙碱溶液(溶于生理盐水)。第一组注射40μg/kg(浓度为3.6μg/ml)；第二组注射16μg/kg(浓度为1.45μg/ml)；第三组注射6.5μg/kg(浓度为0.6μg/ml)；第四组注射2.5μg/kg(浓度为0.225μg/ml)；第五组注射1μg/kg(浓度为0.09μg/ml)；第六组注射0.1μg/kg(浓度为0.009μg/ml)。第七组对照小鼠接受200μl生理盐水注射。24小时后由眼眶静脉抽取约200μl血样，如实施例1所述，用3.8％枸橼酸钠抗凝全血，离心(2500xg，10分钟)，分离贫血小板血浆。血浆中t-PA活性浓度采用小鼠组织纤溶酶原激活物活性免疫酶标法测定试剂盒(mouse t-PA activityELISA assay kit)(Gentaur公司)进行测定。具体操作完全按照试剂盒要求。实验结果见图4。
权利要求
1.一种结构式如下的秋水仙碱及它的衍生物的医学用途在制备预防、治疗由血栓形成或血栓栓塞引起血栓性疾病的药物中应用
2.根据权利要求1所述的秋水仙碱及它的衍生物的医学用途，其特征在于在制备预防、治疗由血栓形成或血栓栓塞引起的血栓性疾病包括心肌梗塞、深静脉血栓和脑梗死、脑血栓、药物中应用。
3.根据权利要求1所述的秋水仙碱及它的衍生物的医学用途，其特征在于在制备由秋水仙碱及它的衍生物组成的组合物包括小剂量阿司匹林，低分子量肝素，Reopro及医学上可接受的载体，赋形剂的药物中应用。
4.根据权利要求3所述的秋水仙碱及它的衍生物的医学用途，其特征在于秋水仙碱及它的衍生物与药学上可接受的载体赋形剂制成片剂、针剂或其它剂型。
5，根据权利要求3所述的秋水仙碱及它的衍生物的医学用途，包括将秋水仙碱及它的衍生物作为主要活性成分，辅助活性成分或添加成分，制备预防、治疗由血栓形成或血栓栓塞引起的血栓性疾病和与血栓形成或血栓栓塞相关的疾病的药物或保健产品。
全文摘要
本发明公开了秋水仙碱及它的衍生物的医学用途，采用低浓度的秋水仙碱及它的衍生物显著提高血管内皮细胞释放人体t－PA，从而促进血液纤维蛋白溶解系统活性升高而促进血栓溶解，从而使其能预防、治疗由血管内血栓形成或栓塞而引起的各种疾病。
文档编号A61K31/726GK1939290SQ20051003015
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者汤英娣, 陆宪光, 李红, 陆凯琳, 陆凯文 申请人:陆宪光, 李红