一种新型胞外多糖及其生产菌株和制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型胞外多糖及其生产菌株和制备方法，属于微生物【技术领域】。该新型胞外多糖为酸性多糖，其在水相中以纳米粒子形态存在，而在二甲基亚砜中溶解完全；在pH3-11范围内结构稳定，碱处理后在中和过程中形成凝胶。可发酵生产该胞外多糖的菌株为肺炎克雷伯氏菌（ Kleibsiellapneumoniae ）PHRC1.001，保藏编号为CCTCC NO：M2014427。以此菌为出发菌株，以碳水化合物为主要碳源，以硝酸盐为主要氮源，进行发酵可生产该新型胞外多糖。本发明获得的新型胞外多糖产品是一种很有市场潜力的亲水胶体添加剂，可应用于絮凝、水泥、陶瓷、食品添加剂等领域中，也可制备金属纳米粒子。CCTCC NO：M 201442720140918
【专利说明】一种新型胞外多糖及其生产菌株和制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及一种新型胞外多糖及其生产菌株和制备方 法。
【背景技术】
[0003] 自黄原胶第一次实现工业化生产并实现巨大商业成功后，微生物多糖的开发引起 了科学界和工业界的浓厚兴趣，纷纷投入人力、物力和财力开展新的具有特殊性能的微生 物多糖研究。
[0004] 微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。微生物胞外多糖 (Exopolysaccharide)是指许多微生物在不同外部条件下的生长活动中分泌到细胞壁外的 多糖或多糖混合物。一方面，胞外多糖容易与菌体分离，可以通过深层发酵来实现工业化生 产。与动植物多糖相比，微生物多糖的生产受气候、地理环境、自然灾害等因素的影响较小， 生产周期短，产量及质量稳定，且微生物多糖安全无毒。另一方面，微生物多糖具有独特的 理化性质，可作为乳化剂、润滑剂、胶凝剂、成膜剂、悬浮剂、增稠剂和稳定剂广泛应用于化 工、农业、石油、制药和食品等多个领域。
[0005] 到目前为止，已研究成熟并投入生产的微生物多糖主要有黄原胶（Xanthan gum)、 威兰胶(Welan gum)、结冷胶（GelIan gum)、小核菌葡聚糖（ScIeeroglucan)、短梗霉多糖 (Pullulan)、热凝多糖（Curdlan)等。世界上微生物多糖的产量和年增长量都在大幅度上 涨，一些新型多糖的年增长量也达到了 30%以上，据估计，全世界微生物多糖的年工业产值 可达几百亿美元。但是国内微生物多糖的研究和生产创新性研究有待提高，国内首次发现 的有工业化潜力的新型微生物多糖不多，且相关的专利报道也很少，所以值得大力开展新 型微生物多糖的研究。
[0006] 克雷伯氏菌OWei/wie/a 是一种能够产胞外多糖的微生物，国内外 克雷伯氏菌多糖相关的专利很少，而在非专利性的一些文章中，一些研究者报道了克雷伯 氏菌多糖可应用于免疫活性调节、吸附重金属离子、絮凝等；但文献报道中，克雷伯氏菌多 糖单位产量低（<15g/L)，碳源转化率低，很难实现大规模工业生产，且没有特殊的流变学特 性，在应用上有一定的局限性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于：提供一种新型胞外多糖，该多糖具有良好的酸碱稳定性和特 殊的碱处理凝胶特性；提供能够发酵生产该新型胞外多糖的微生物菌株，以及使用该菌株 制备新型胞外多糖的方法。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一株生产新型胞外多糖的菌株，从湖北省武汉纺织大学污水处理厂的活性污泥中筛 选得到，该菌株于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉)，其分类 命名为肺炎克雷伯氏菌OVeiZwieBa /we應PHRC1. 001，保藏编号为CCTCC NO :M 2014427。
[0009] -种新型胞外多糖，由上述菌株肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001发酵生产得到。经化 学组分分析和理化性质研究表明，该胞外多糖是一种酸性多糖，在水相中以纳米粒子形态 存在，而在二甲基亚砜中溶解完全，在pH 3-11范围内结构稳定，碱处理后的胞外多糖在中 和过程中形成凝胶。
[0010] 一种使用肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001制备新型胞外多糖的方法，包括如下步骤： (1) 种子培养 种子液体培养基：葡萄糖10-30g/L，氯化钾5-20g/L，蛋白胨5-10g/L，pH 7. 0 ; 将肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001菌种接种于种子液体培养基中，在30-35°C、振荡速度为 150-300rpm的条件下培养10-24h来获得种子培养液； (2) 发酵培养 发酵培养基：蔗糖10_50g/L，硝酸钾l-10g/L，磷酸二氢钠 l-10g/L，七水合硫酸镁 l-10g/L，氯化钙 0· 5-2g/L，pH 7. 0 ; 种子培养液以2. 5-10%的接种量接种于发酵培养基中，在25-30°C、振荡速度为 200-500rpm、空气流量为5-30mV(L · h)的条件下，发酵48-96h生产胞外多糖。
[0011] 所述的制备新型胞外多糖的方法还包括如下处理步骤：将发酵液先于80-KKTC 水浴灭活菌体，再经离心除去菌体；发酵上清液中加入2-5倍体积的乙醇，静置12-24h，使 胞外多糖成纤维状析出，用300-500目的滤布过滤收集胞外多糖沉淀；将胞外多糖沉淀复 溶于水中，配成0.5-5%的多糖水溶液，以多糖水溶液：Sevag试剂=(2?4):1 (v/v)的比 例加入Sevag试剂(正丁醇：氯仿=1: (3?5) (v/v))沉淀去除蛋白，离心获得上清液，重 复2-5次；将多糖水溶液(上清液)真空浓缩至浓度10-30%，采用真空干燥或冷冻干燥，研磨 制得胞外多糖粉末。所得到的胞外多糖粉末可以再溶于水中通过透析进一步纯化。
[0012] 本发明的有益效果：提供了 一种发酵生产新型胞外多糖的菌株 PHRC1. 001，并确定了最优的发酵培养基、发酵条件和发酵后处理制备方法，获 得了该微生物多糖粉末。该新型胞外多糖在水相中以纳米粒子形态存在，而在二甲基亚砜 中溶解完全，同时具有良好的酸碱稳定性和特殊的碱处理凝胶特性，是一种很有市场潜力 的亲水胶体添加剂，可应用于絮凝、水泥、陶瓷、食品添加剂等领域中，也可用于制备金属纳 米粒子。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是实施例1所筛选产糖菌株的菌落形态图。
[0014] 图2是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001在显微镜下的形态图。
[0015] 图3是肺炎克雷伯氏菌PHRCL 001悬液的OD (600nm)与菌体干重DCW (g/L)之 间关系的标准曲线图。
[0016] 图4是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001在7L发酵罐中发酵过程的各参数曲线。
[0017] 图5是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖溶解在不同溶剂中的粒径分布图。
[0018] 图6是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖水溶液在透射电镜下的形态。
[0019] 图7是pH对肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖粘度和结构的影响。
[0020] 图8是pH为14对肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖形成凝胶的影响。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本 发明的范围。
[0022] 实施例1胞外多糖产生菌的筛选及鉴定 (1)样品采集和预处理 从湖北省武汉纺织大学污水处理厂的活性污泥中取样。将收集的样品放入冰袋旁冷 藏，保持在较低温度的环境下带回实验室并尽快进行处理。取固液混合样品IOg放入装有 150mL、0. 9%无菌生理盐水的250mL锥形瓶中，振荡均匀后备用。
[0023] (2)产糖菌株的初步分离 使用0. 9%无菌生理盐水以体积计按照KT1-KT8的梯度对上述预处理样品进行连续稀 释，在每个稀释度取〇. ImL稀释样品，分别涂布平板，在30°C条件下恒温培养36-72h，用无 菌接种环挑取较大且粘稠的单菌落，菌落形态如图1所示，粘稠的菌株周围被一圈粘性多 糖包围着。然后在相应的平板上划线分离，得到纯的单菌落，共分离出40株菌。纯化的菌 株保藏在斜面培养基上，冰箱4°C保存。
[0024] (3)产糖菌株的二次分离 将40株菌通过如下方法进行发酵生产胞外多糖： 1)种子培养 种子液体培养基：葡萄糖15g/L，氯化钾5g/L，蛋白胨7g/L，pH 7. 0,自来水配制； 将斜面保藏的菌种接种于种子液体培养基中，在30°C、振荡速度为220rpm的条件下培 养12h来获得种子培养液。
[0025] 2)发酵培养 发酵培养基：蔗糖40g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾2. 6g/L，七水合硫酸镁2g/L，氯化钙 0. 5g/L，pH 7. 0,自来水配制； 种子培养液以2. 5%的接种量接种于发酵培养基中，在30°C、振荡速度为220rpm、空气 流量为60mV(L · h)的条件下，发酵72h生产胞外多糖。
[0026] 测定发酵液的粘度和胞外多糖粗产量，最终获得一株菌粗多糖的产量和发酵液表 观粘度都相对较高，结合菌落的粘度，选取这株菌，命名为PHRC1. 001。
[0027] 其中，测定发酵液表观粘度的方法为：在25°C时，采用椎板转子（C60/l°，Til， gap 0.052mm)，在稳态剪切模式下，剪切速率为0.01-500 1/s时，用Haake Rheostress 6000旋转流变仪测定发酵液的表观粘度。
[0028] 测定胞外多糖粗产量的方法为：取20mL发酵液先于SO-KKTC水浴灭活菌体，经 lOOOOr/min离心20min除去菌体；发酵上清液中加入2-5倍体积的乙醇，静置12-24h，使胞 外多糖成纤维状析出，用300-500目的滤布过滤收集胞外多糖沉淀；将多糖沉淀放于真空 干燥箱中35_45°C真空干燥3_4h，称得的总质量数值减去滤布质量后的数值与发酵液体积 的比值即为胞外多糖粗产量，单位为g/L。
[0029] 将筛选的菌株PHRC1. 001进行革兰氏染色，显微镜下观察菌株的形态，如图2所 示，此株菌为革兰氏阴性菌，呈短杆状。
[0030] (4)筛选菌株的鉴定 将菌株PHRC1. 001送生工生物工程(上海）股份有限公司进行16S rDNA分子生物学鉴 定。将该株细菌测序结果在GenBank数据库中进行Blast,根据16S rDNA的序列分析比对， 将筛选菌株鉴定为肺炎克雷伯氏菌该菌株已于2014年9月18 日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉)，其保藏编号为CCTCC NO :M 2014427。
[0031] 实施例2蔗糖浓度对肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001产胞外多糖的影响 将蔗糖作为碳源，按照酵母膏3g/L，磷酸二氢钾2. 6g/L，七水合硫酸镁2g/L，氯化钙 0.5g/L，pH 7.0,配制成不同蔗糖浓度的发酵培养基，按实施例1中所述的方法进行发酵培 养，结果发现在蔗糖浓度较低时，菌体主要进行自身的生长，代谢产糖活动比较缓慢，随着 蔗糖浓度的增大，菌体量和产糖量都在增加，但在40g/L时达到最大，而随着蔗糖浓度的继 续增大，就会抑制菌体的生长和糖的积累，故确定蔗糖浓度为40g/L。蔗糖浓度对发酵产胞 外多糖的影响如表1所示。
[0032] 表1 鹿糖浓度对
【权利要求】
1. 一株生产胞外多糖的菌株，其特征在于：分类命名为肺炎克雷伯氏菌 應o/?iae)PHRCl. 001，保藏编号为 CCTCC NO :M 2014427。
2. 使用权利要求1所述的菌株制备新型胞外多糖的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 种子培养 将权利要求1所述的菌株菌种接种于种子液体培养基中，在30-35°C、振荡速度为 150-300rpm的条件下培养10-24h来获得种子培养液；所述的种子液体培养基为：葡萄糖 10-30g/L，氯化钾 5-20g/L，蛋白胨 5-10g/L，pH 7. 0 ; (2) 发酵培养 种子培养液以2. 5-10%的接种量接种于发酵培养基中，在25-30°C、振荡速度为 200-500rpm、空气流量为30-60mV(L ? h)的条件下，发酵48-96h生产胞外多糖；所述的发 酵培养基为：蔗糖10_50g/L，硝酸钾l-10g/L，磷酸二氢钠l-10g/L，七水合硫酸镁l-10g/L， 氯化钙 0. 5-2g/L，pH 7. 0。
3. 根据权利要求2所述的制备新型胞外多糖的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的 发酵培养基为：蔗糖40g/L，硝酸钾2g/L，磷酸二氢钠3. 5g/L，七水合硫酸镁7g/L，氯化钙 0? 8g/L, pH 7. 0。
4. 根据权利要求2所述的制备新型胞外多糖的方法，其特征在于还包括如下处理步 骤：将发酵液先于80-100°C水浴灭活菌体，再经离心除去菌体；发酵上清液中加入2-5倍体 积的乙醇，静置12-24h，使胞外多糖成纤维状析出，用300-500目的滤布过滤收集胞外多糖 沉淀；将胞外多糖沉淀复溶于水中，配成〇. 5-5%的多糖水溶液，以多糖水溶液：Sevag试剂 =(2?4) :1的比例加入Sevag试剂沉淀去除蛋白，离心获得上清液，重复2-5次；将多糖 水溶液真空浓缩至浓度10-30%，真空干燥或冷冻干燥，研磨制得胞外多糖粉末。
5. 根据权利要求4所述的制备新型胞外多糖的方法，其特征在于：将胞外多糖粉末再 溶于水中通过透析纯化。
6. -种新型胞外多糖，其特征在于：通过权利要求2-5任一项所述的方法制备得到。
7. 根据权利要求6所述的新型胞外多糖，其特征在于：所述的新型胞外多糖为酸性多 糖。
8. 根据权利要求6所述的新型胞外多糖，其特征在于：所述的新型胞外多糖在水相中 以纳米粒子形态存在，在二甲基亚砜中溶解完全。
9. 根据权利要求6所述的新型胞外多糖，其特征在于：所述的新型胞外多糖在pH 3-11 范围内结构稳定。
10. 根据权利要求6所述的新型胞外多糖，其特征在于：所述的新型胞外多糖碱处理后 在中和过程中形成凝胶。
【文档编号】C12N1/20GK104403981SQ201410786092
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】方亚鹏, 崔娜娜, 赵萌 申请人:湖北工业大学